Organell-Transport in kultivierten<em> Drosophila</em> Zellen: S2-Zelllinie und primären Neuronen.
Summary
Drosophila S2-Zellen und kultivierten Neuronen sind große Systeme für die Bildgebung von motorbetriebenen Organellentransport in vivo. Hier beschreiben wir ausführliche Protokolle für die Kultivierung beider Zelltypen, die Abbildung und Analyse des Verkehrs.
Abstract
Drosophila-S2-Zellen auf einem Deckglas überzogen in das Vorhandensein von Aktin-Depolymerisation Arzneiform lange unverzweigte Prozesse einheitlich polarisiert Mikrotubuli gefüllt. Organellen bewegen sich entlang dieser Prozesse durch Mikrotubuli-Motoren. Einfache Wartung, hohe Empfindlichkeit für RNAi-vermittelten Protein-knock-down und effiziente Verfahren für die Erstellung von stabilen Zelllinien machen Drosophila S2-Zellen ein ideales Modellsystem für Frachttransport durch Live-Bildgebung zu untersuchen. Axonalen Transport in primären Neuronen von Drosophila-Embryonen kultiviert dissoziiert: Die mit S2-Zellen erhaltenen Ergebnisse weiter zu einer physiologisch relevanten System angewendet werden. Kultivierten Neuronen wachsen lange Neuriten mit gebündelten Mikrotubuli, sehr ähnlich S2 Prozesse gefüllt. Wie in S2-Zellen, Organellen kann in kultivierten Neuronen entweder durch Organell-spezifischen Fluoreszenzfarbstoffen oder durch Verwendung von fluoreszierenden Organellen-Marker von DNA kodiert visualisiert werden in frühen Embryonen injiziert oder in transgen exprimiertic fliegt. Daher kann Organelltransport leicht in Neuronen auf Deckgläser mit lebendigen Bild kultiviert aufgezeichnet werden. Hier beschreiben wir Verfahren zur Kultivierung und Visualisierung Frachtverkehr in Drosophila S2-Zellen und primäre Neuronen. Wir glauben, dass diese Protokolle beide Systeme zugänglich für Labore Studium Frachtverkehr zu machen.
Introduction
Drosophila S2-Zellen haben sich zunehmender Beliebtheit für das Studium vieler zellulärer Prozesse gewonnen. Diese Zellen wurden ursprünglich aus Trypsin späten Stadium Embryonen von Drosophila melanogaster OregonR erhalten und zu pflegen Makrophagen-ähnliche Funktionen ein. Drosophila S2-Zellen bieten viele Vorteile gegenüber anderen Zelllinien. Sie kultiviert bei 25 ° C ohne CO 2, und kann für viele Stunden bei Raumtemperatur abgebildet werden, ohne die Notwendigkeit einer Erwärmung oder Gasaustausch. Noch wichtiger ist, Drosophila S2-Zellen sind sehr empfindlich auf RNAi-Behandlung ermöglicht hohe Effizienz Knockdown von Proteinen von Interesse. S2-Zellen sind sehr transfizierbar und stabile Zelllinien können in weniger als vier Wochen gewählt werden, um stabile ektopische Expression von Proteinen von Interesse zu ermöglichen. S2-Zellen normal wachsen entweder lose befestigt, aber nicht auf einen Kolben oder in Suspension zu verbreiten. Sie können bewogen, auf Deckgläsern mit einer Pflanze Lektin conca schwemmt verteilt werdennavalin A (ConA). Der Umfang der ausgebreiteten Zellen ist besonders dünn und ist somit ideal für Lebendzellmikroskopie. Detaillierte Protokolle für die S2-Zellen Kultur, RNAi-Behandlung, Live-Licht-Bildgebung und Immunfärbung in der Literatur 2,3 gefunden werden. Unser Labor hat S2-Zellen als Modellsystem, um Mikrotubuli-basierte Frachtverkehr zu studieren. Drosophila S2-Zellen mit jedem Medikament, das depolymerisiert oder trennt F-Actin, wie Cytochalasin D (CytoD) behandelt, wachsen lange Prozesse einheitlich polarisiert Mikrotubuli 4 gefüllt angenommen -10, die es zu einem idealen System für Fracht Bewegung entlang Mikrotubuli studieren. Verschiedene Parameter des Verkehrs in diesen Prozessen (. Dh Trajektorien Längen, Geschwindigkeiten, Richtungs etc) leicht mit automatisierten Partikel-Tracking-Software, DiaTrack (Semasopht gemessen werden: http://www.microscopy.info/Organization/Details/4423, Dr. . Pascal Vallotton: http://www.csiro.au/en/Organisation-Structure/Divisions/Mathematics-Informatics-and-Statistics/PascalVallotton.aspx # a4). Diese Eigenschaften machen S2-Zellen eine ansprechende System für die Untersuchung Frachtverkehr entlang von Mikrotubuli in Gewebekulturzellen.
Pilotversuche in S2-Zellen kann zu einer physiologisch wichtigen Modell der Frachttransportstudien in Drosophila primären Neuronen erweitert werden. Ähnlich S2-Zellen sind Neuronen aus dissoziierten Embryonen kultiviert durchlässig für kleine Moleküle wie Farbstoffe und Inhibitoren und hochauflösende Live-Darstellung von Organellen-Transport in Nervenzellen bei Raumtemperatur durchgeführt werden. Mit Drosophila mit unterschiedlichen genetischen Hintergründen können wir Gen-Funktion in primären Neuronen untersuchen, durch Knockout (genetische loss-of-function Mutationen), Zuschlag (dsRNA Injektion oder Ausdruck) oder ektopische Expression (transgene Linie). Insbesondere ist die Fragmentierung von Aktin-Filamenten mit CytoD Behandlung nicht verhindert Neuritenwachstum, sondern sie schneller wachsen und somit können wir Mikrotubuli-depende studierennt Organellentransport in CytoD behandelten Neuronen ohne den Einfluss von Aktin-Filamenten 11. Daher primären neuronalen Kulturen verbinden die Vorteile von Gewebekulturzellen und fliegen Genetik, das es ein großartiges System für Frachttransport in einem physiologisch relevanten System 10,12 studieren. Da mehrere familiäre neurodegenerative Erkrankungen durch verursacht werden oder mit Frachttransportdefekte (zB Parkinson-Krankheit 13 in Verbindung gebracht werden, Huntington-Krankheit 14, Alzheimer-Krankheit 15,16, Amyotrophe Lateralsklerose / ALS 17, HMN7B und Perry-Syndrom 18,19 und Spinocerebellar Ataxie Typ 5/SCA5 20) können primären neuronalen Kulturen nützlich bei der Analyse der Wirkungen von bestimmten Mutationen, die diese Krankheiten auf Mikrotubuli-abhängigen Transport sein.
Schließlich werden wichtige Eigenschaften der Mikrotubuli-abhängigen Transport auch zwischen Säugetieren und Fliegen erhalten, aber <em> Drosophila Gen-und Zellkultur ist weniger teuer und zeitaufwendig ist, rechtfertigt die Verwendung von kultivierten Drosophila-Zellen für die Untersuchung wesentlichen Aspekte der Organellentransport in normalen und pathologischen Bedingungen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier präsentieren wir Ihnen ausführliche Protokolle für die Untersuchung der Mikrotubuli-abhängige Frachtverkehr in Drosophila S2-Zellen und primäre Neuronenkultur. Beide S2 Prozesse und Neuriten sind Strukturen von gebündelten Mikrotubuli-Arrays, die als Spuren für Organellentransport dienen gefüllt.
Zwei Strategien werden in der Regel Label Organellen verwendet: Transfektion von Vektoren ein fluoreszierendes Protein kodiert, mit einem Organell-Targeting-Sequenz oder Färbu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken den Mitgliedern des Gelfand Labor, die zur Entwicklung dieser Protokolle beigetragen. Forschung in dieser Veröffentlichung berichtet, wurde durch das National Institute of General Medical Science der National Institutes of Health unter Verleihungsnummer R01GM052111 an die VIG und baskischen Regierung Ministerium für Bildung, Hochschulen und Forschung unter Verleihungsnummer BFI-2011-295 bis UDC unterstützt.
Materials
| Powder Insect cell medium (Schneider’s) | Sigma | S9895 |
| Insect –Xpress medium | Fisher | BW12730Q |
| Insulin | Sigma | I6634 |
| Penicillin | Research Products International | P93000 |
| Streptomycin | Research Products International | S62000 |
| Tetracycline hydrochloride | Sigma | T7660-5G |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 |
| Concanavalin A | Sigma | C2010 |
| Cytochalasin D | VWR | IC15077105 |
| LysoTracker Red DND-99 | Molecular Probes | L7528 |
| 100 µm Cell strainer | Fisher Scientific | 22363549 |
| 25 mm Circle cover glass | VWR | 48380 080 |
| Drosophila Vials | VWR | 89092-730 |
| Disposable pellet pestles with matching microtubes | Kimble Chase | 749520-0000 |
References
- Schneider, I. Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster. J. Embryol. Exp. Morphol. 27, 353-365 (1972).
- Rogers, S. L., Rogers, G. C. Culture of Drosophila S2 cells and their use for RNAi-mediated loss-of-function studies and immunofluorescence. 3, 606-611 (2008).
- Buster, D. W., Nye, J., Klebba, J. E., Rogers, G. C. Preparation of Drosophila S2 cells for light microscopy. J. Vis. Exp. (40), e1982 (2010).
- Ling, S. C., Fahrner, P. S., Greenough, W. T., Gelfand, V. I. Transport of Drosophila fragile X mental retardation protein-containing ribonucleoprotein granules by kinesin-1 and cytoplasmic dynein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 17428-17433 (2004).
- Kural, C., et al. Kinesin and dynein move a peroxisome in vivo: a tug-of-war or coordinated movement. Science. 308, 1469-1472 (2005).
- Kim, H., et al. Microtubule binding by dynactin is required for microtubule organization but not cargo transport. J. Cell. Biol. 176, 641-651 (2007).
- Ally, S., Larson, A. G., Barlan, K., Rice, S. E., Gelfand, V. I. Opposite-polarity motors activate one another to trigger cargo transport in live cells. J. Cell. Biol. 187, 1071-1082 (2009).
- Bensenor, L. B., Barlan, K., Rice, S. E., Fehon, R. G., Gelfand, V. I. Microtubule-mediated transport of the tumor-suppressor protein Merlin and its mutants. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 7311-7316 (2010).
- Jolly, A. L., et al. Kinesin-1 heavy chain mediates microtubule sliding to drive changes in cell shape. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 12151-12156 (2010).
- Barlan, K., Lu, W., Gelfand, V. I. The microtubule-binding protein ensconsin is an essential cofactor of Kinesin-1. Curr. Biol. 23, 317-322 (2013).
- Lu, W., Fox, P., Lakonishok, M., Davidson, M. W., Gelfand, V. I. Initial Neurite Outgrowth in Drosophila Neurons Is Driven by Kinesin-Powered Microtubule Sliding. Curr. Biol. 23, 1018-1023 (2013).
- Pathak, D., Sepp, K. J., Hollenbeck, P. J. Evidence that myosin activity opposes microtubule-based axonal transport of mitochondria. J. Neurosci. 30, 8984-8992 (2010).
- Clark, I. E., et al. Drosophila pink1 is required for mitochondrial function and interacts genetically with parkin. Nature. 441, 1162-1166 (2006).
- Gunawardena, S., et al. Disruption of axonal transport by loss of huntingtin or expression of pathogenic polyQ proteins in Drosophila. Neuron. 40, 25-40 (2003).
- Koo, E. H., et al. Precursor of amyloid protein in Alzheimer disease undergoes fast anterograde axonal transport. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 1561-1565 (1990).
- Stokin, G. B., Goldstein, L. S. Axonal transport and Alzheimer’s disease. Annu. Rev. Biochem. 75, 607-627 (2006).
- Bilsland, L. G., et al. Deficits in axonal transport precede ALS symptoms in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 20523-20528 (2010).
- Lloyd, T. E., et al. The p150(Glued) CAP-Gly domain regulates initiation of retrograde transport at synaptic termini. Neuron. 74, 344-360 (2012).
- Moughamian, A. J., Holzbaur, E. L. Dynactin is required for transport initiation from the distal axon. Neuron. 74, 331-343 (2012).
- Lorenzo, D. N., et al. Spectrin mutations that cause spinocerebellar ataxia type 5 impair axonal transport and induce neurodegeneration in Drosophila. J. Cell. Biol. 189, 143-158 (2010).
- Robinow, S., White, K. The locus elav of Drosophila melanogaster is expressed in neurons at all developmental stages. Dev. Biol. 126, 294-303 (1988).
- Pilling, A. D., Horiuchi, D., Lively, C. M., Saxton, W. M. Kinesin-1 and Dynein are the primary motors for fast transport of mitochondria in Drosophila motor axons. Mol. Biol. Cell. 17, 2057-2068 (2006).
- Furst, A., Mahowald, A. P. Differentiation of primary embryonic neuroblasts in purified neural cell cultures from Drosophila. Dev. Biol. 109, 184-192 (1985).
- Salvaterra, P. M., Bournias-Vardiabasis, N., Nair, T., Hou, G., Lieu, C. In vitro neuronal differentiation of Drosophila embryo cells. J. Neurosci. 7, 10-22 (1987).
- Wiemer, E. A., Wenzel, T., Deerinck, T. J., Ellisman, M. H., Subramani, S. Visualization of the peroxisomal compartment in living mammalian cells: dynamic behavior and association with microtubules. J. Cell. Biol. 136, 71-80 (1997).
- Rizzuto, R., et al. A gene specifying subunit VIII of human cytochrome c oxidase is localized to chromosome 11 and is expressed in both muscle and non-muscle tissues. J. Biol. Chem. 264, 10595-10600 (1989).
- Poot, M., et al. Analysis of mitochondrial morphology and function with novel fixable fluorescent stains. J. Histochem. Cytochem. 44, 1363-1372 (1996).
- Haller, T., Dietl, P., Deetjen, P., Volkl, H. The lysosomal compartment as intracellular calcium store in MDCK cells: a possible involvement in InsP3-mediated Ca2+ release. Cell Calcium. 19, 157-165 (1996).
