Kültürlü organel Ulaşım<em> Drosophila</em> Hücreler: S2 Hücre Hattı ve İlköğretim Nöronlar.
Summary
Drosophila S2 hücreleri ve kültürlenmiş nöronların in vivo olarak motor tahrikli bir organel taşıma görüntüleme için büyük sistemlerdir. Burada, her iki hücre kültür tipleri için, görüntüleme ve taşıma analiz protokolleri ayrıntılı tarif etmektedir.
Abstract
Drosophila S2 hücrelerinin homojen bir polarize mikrotübüller ile dolu bir aktin-depolimerizasyon ilaç formu uzun dallanmamış süreçlerin mevcudiyetinde bir lamel üzerine kaplanmıştır. Organelleri mikrotübül motorları ile bu işlemler boyunca hareket eder. Kolay bakım, RNAi protein knock-down ve istikrarlı hücre hatları oluşturmak için verimli bir prosedüre yüksek hassasiyet Drosophila S2 hücreleri canlı görüntüleme ile kargo taşımacılığı çalışma için ideal bir model sistemi yapmak. Ayrışmış Drosophila embriyolardan kültür primer nöronlarda aksonal taşıma araçları: S2 hücreleri ile elde edilen sonuçlar ayrıca, daha fazla fizyolojik olarak uygun bir sistemin uygulanabilir. Kültürlü nöronlar S2 işlemlere benzer birlikte mikrotübüllerin, dolu uzun nöritler büyür. Gibi S2 hücrelerindeki, kültüre edilmiş nöronlarda organeller ya organel-spesifik floresan boyalar veya DNA tarafından kodlanan bir organel fluoresan işaretleyiciler kullanılarak görüntülenebilir erken embriyolar içine enjekte edilen ya da transgen ekspreseic uçar. Bu nedenle, organel ulaşım kolaylıkla yaşayan görüntüleme kullanarak cam lamelleri kültüre nöronlar kaydedilebilir. Burada Drosophila S2 hücreleri ve primer nöronlar kargo taşımacılığı kültüre ve görselleştirmek için prosedürler açıklanmaktadır. Biz bu protokoller kargo taşımacılığı eğitim laboratuarları için her iki sistemin erişilebilir hale inanıyoruz.
Introduction
Drosophila S2 hücreler birçok hücresel süreçleri incelemek için artan popülerlik kazanmıştır. Bu hücreler başlangıçta OregonR Drosophila melanogaster tripsinlendi geç dönem embriyo elde edildi ve 1.. Drosophila S2 hücreleri diğer hücre hatları üzerinden pek çok avantajı sunmaktadır makrofaj gibi özelliklerini korumak edildi. Bu CO2 olmadan 25 ° C'de kültürlenir ve ısıtma veya gaz değişimi ihtiyacı olmadan, oda sıcaklığında saatlerce görüntülenebilir. Daha da önemlisi, Drosophila S2 hücreleri, ilgi konusu olan proteinlerin yüksek verimlilik sağlayan demonte RNAi tedaviye çok duyarlıdır. S2 hücreleri yüksek oranda transfectable ve kararlı hücre soyları ilgi konusu olan proteinlerin kararlı ektopik ifade izin vermek için en az dört hafta içinde seçilebilir. S2 hücreleri normalde ya büyümeye gevşek bağlı olduğu, ancak, bir şişe ya da süspansiyon içinde yayılmaz. Bir bitki lektin Conca ile önceden kaplanmış lameller üzerine yaymak için indüklenebilirnavalin A (ConA). Yayılmış hücrelerin çevresi özellikle incedir ve bu nedenle canlı hücre mikroskopi için idealdir. S2 hücreleri kültür, RNAi tedavisi, canlı ışık görüntüleme ve immün için ayrıntılı protokoller literatür 2,3 bulunabilir. Bizim laboratuvar. Gibi sitokalasin D gibi F-aktin depolimerize veya sunucularının herhangi bir ilaç, (CytoD) ile muamele Drosophila S2 hücrelerinin homojen bir polarize mikrotübül 4 ile doldurulmuş uzun süreçler büyümesi mikrotübül göre yük taşıma çalışmak için bir model sistem olarak S2 hücreleri benimsemiştir -10, bu mikrotübül diziler boyunca kargo hareketini incelemek için ideal bir sistem yapar. Bu süreçlerin farklı ulaşım parametreleri (. Yani yörüngeleri uzunlukları, hızlar, yön vb) kolayca otomatik partikül izleme yazılımı, DiaTrack (Semasopht kullanılarak ölçülebilir: http://www.microscopy.info/Organization/Details/4423; Dr . Pascal Vallotton: http://www.csiro.au/en/Organisation-Structure/Divisions/Mathematics-Informatics-and-Statistics/PascalVallotton.aspx # a4). Bu özellikler S2 hücreleri doku kültürü hücrelerin mikrotübüllerinde birlikte kargo taşımacılığı eğitimi için cazip bir sistem yapmak.
S2 hücrelerinde Pilot Deneyler Drosophila birincil nöronlar kargo taşımacılığı çalışmalar fizyolojik olarak önemli bir örnek için uzatılabilir. S2 hücrelerine benzer şekilde, ayrışmış embriyolardan kültür nöronları gibi boyalar ve inhibitörleri gibi küçük moleküllere karşı geçirgen olan ve organel taşıma yüksek çözünürlüklü canlı görüntüleme oda sıcaklığında nöronlarda gerçekleştirilebilir. Farklı genetik geçmişleri ile Drosophila kullanarak, nakavtla (genetik kayıp fonksiyon-mutasyonlar) primer nöronlar gen fonksiyonunu inceleyebilirsiniz, demonte (dsRNA enjeksiyon ya da ifade) veya ektopik ifadesi (transgenik sinekler). Özellikle, CytoD tedavi kullanarak aktin filamentler parçalanması nörit gelişimini engellemez, onun yerine daha hızlı büyür ve böylece biz mikrotübül-depende eğitim görebilirsinizaktin etkisi olmadan CytoD ile muamele edilmiş nöronlarda nt organel nakil 11, parçalanmış olması gerekir. Bu nedenle, birincil nöronal kültürlerin bir fizyolojik ilgili sisteme 10,12 kargo taşımacılığı çalışma için harika bir sistem kılan, doku kültürü hücreleri avantajlarını birleştirmek ve genetik sinek. Birkaç ailesel nörodejeneratif hastalıkların yol açtığı veya kargo taşımacılığı kusurları (örneğin Parkinson hastalığı 13 ile ilişkili olabilir bu yana, Huntington hastalığı 14, Alzheimer Hastalığı 15,16, Amyotrofik Lateral Skleroz / ALS 17, HMN7B ve Perry sendromu 18,19 ve Spinoserebellar ataksi tip 5/SCA5 20), ve primer nöron kültürlerinden mikrotübüle bağlı taşıtlarda, bu hastalıklara neden olan belirli bir mutasyon etkilerinin analizinde yararlı olabilir.
Son olarak, mikrotübül-bağlı taşıma önemli özellikleri de memeli hayvanlarda ve sinekler arasında muhafaza, fakat <em> Drosophila genetik ve hücre kültürü, normal ve patolojik koşullarda organel taşıma temel yönlerini incelemek için kültürlenmiş Drosophila hücrelerinin kullanımını haklı, daha az pahalı ve zaman alıcıdır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada Drosophila S2 hücreleri ve primer nöron kültürü mikrotübül bağımlı kargo taşımacılığı eğitimi için ayrıntılı protokoller mevcut. Hem S2 süreçler ve nevrotiler organel ulaşım için parça olarak hizmet bohça mikrotübülüsleri diziler tarafından doldurulur yapılardır.
Iki strateji genellikle etiket organellere kullanılır: kültürlere doğrudan ilave floresan boyalar ile bir organel-hedefleyen dizisi ya da boyama ile bir floresan proteini kodlay…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz bu protokollerin gelişmesine katkıda Gelfand laboratuar üyelerine teşekkür ederim. Bu yayında bildirilen araştırma ödülü numarası BFI-2011-295 Udc için altında VIG ödül sayısı R01GM052111 altında Ulusal Sağlık Enstitüleri Genel Tıp Bilimleri Ulusal Enstitüsü tarafından ve Bask Devlet Eğitimi Bölümü, Üniversiteler ve Araştırma tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Powder Insect cell medium (Schneider’s) | Sigma | S9895 |
| Insect –Xpress medium | Fisher | BW12730Q |
| Insulin | Sigma | I6634 |
| Penicillin | Research Products International | P93000 |
| Streptomycin | Research Products International | S62000 |
| Tetracycline hydrochloride | Sigma | T7660-5G |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 |
| Concanavalin A | Sigma | C2010 |
| Cytochalasin D | VWR | IC15077105 |
| LysoTracker Red DND-99 | Molecular Probes | L7528 |
| 100 µm Cell strainer | Fisher Scientific | 22363549 |
| 25 mm Circle cover glass | VWR | 48380 080 |
| Drosophila Vials | VWR | 89092-730 |
| Disposable pellet pestles with matching microtubes | Kimble Chase | 749520-0000 |
References
- Schneider, I. Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster. J. Embryol. Exp. Morphol. 27, 353-365 (1972).
- Rogers, S. L., Rogers, G. C. Culture of Drosophila S2 cells and their use for RNAi-mediated loss-of-function studies and immunofluorescence. 3, 606-611 (2008).
- Buster, D. W., Nye, J., Klebba, J. E., Rogers, G. C. Preparation of Drosophila S2 cells for light microscopy. J. Vis. Exp. (40), e1982 (2010).
- Ling, S. C., Fahrner, P. S., Greenough, W. T., Gelfand, V. I. Transport of Drosophila fragile X mental retardation protein-containing ribonucleoprotein granules by kinesin-1 and cytoplasmic dynein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 17428-17433 (2004).
- Kural, C., et al. Kinesin and dynein move a peroxisome in vivo: a tug-of-war or coordinated movement. Science. 308, 1469-1472 (2005).
- Kim, H., et al. Microtubule binding by dynactin is required for microtubule organization but not cargo transport. J. Cell. Biol. 176, 641-651 (2007).
- Ally, S., Larson, A. G., Barlan, K., Rice, S. E., Gelfand, V. I. Opposite-polarity motors activate one another to trigger cargo transport in live cells. J. Cell. Biol. 187, 1071-1082 (2009).
- Bensenor, L. B., Barlan, K., Rice, S. E., Fehon, R. G., Gelfand, V. I. Microtubule-mediated transport of the tumor-suppressor protein Merlin and its mutants. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 7311-7316 (2010).
- Jolly, A. L., et al. Kinesin-1 heavy chain mediates microtubule sliding to drive changes in cell shape. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 12151-12156 (2010).
- Barlan, K., Lu, W., Gelfand, V. I. The microtubule-binding protein ensconsin is an essential cofactor of Kinesin-1. Curr. Biol. 23, 317-322 (2013).
- Lu, W., Fox, P., Lakonishok, M., Davidson, M. W., Gelfand, V. I. Initial Neurite Outgrowth in Drosophila Neurons Is Driven by Kinesin-Powered Microtubule Sliding. Curr. Biol. 23, 1018-1023 (2013).
- Pathak, D., Sepp, K. J., Hollenbeck, P. J. Evidence that myosin activity opposes microtubule-based axonal transport of mitochondria. J. Neurosci. 30, 8984-8992 (2010).
- Clark, I. E., et al. Drosophila pink1 is required for mitochondrial function and interacts genetically with parkin. Nature. 441, 1162-1166 (2006).
- Gunawardena, S., et al. Disruption of axonal transport by loss of huntingtin or expression of pathogenic polyQ proteins in Drosophila. Neuron. 40, 25-40 (2003).
- Koo, E. H., et al. Precursor of amyloid protein in Alzheimer disease undergoes fast anterograde axonal transport. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 1561-1565 (1990).
- Stokin, G. B., Goldstein, L. S. Axonal transport and Alzheimer’s disease. Annu. Rev. Biochem. 75, 607-627 (2006).
- Bilsland, L. G., et al. Deficits in axonal transport precede ALS symptoms in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 20523-20528 (2010).
- Lloyd, T. E., et al. The p150(Glued) CAP-Gly domain regulates initiation of retrograde transport at synaptic termini. Neuron. 74, 344-360 (2012).
- Moughamian, A. J., Holzbaur, E. L. Dynactin is required for transport initiation from the distal axon. Neuron. 74, 331-343 (2012).
- Lorenzo, D. N., et al. Spectrin mutations that cause spinocerebellar ataxia type 5 impair axonal transport and induce neurodegeneration in Drosophila. J. Cell. Biol. 189, 143-158 (2010).
- Robinow, S., White, K. The locus elav of Drosophila melanogaster is expressed in neurons at all developmental stages. Dev. Biol. 126, 294-303 (1988).
- Pilling, A. D., Horiuchi, D., Lively, C. M., Saxton, W. M. Kinesin-1 and Dynein are the primary motors for fast transport of mitochondria in Drosophila motor axons. Mol. Biol. Cell. 17, 2057-2068 (2006).
- Furst, A., Mahowald, A. P. Differentiation of primary embryonic neuroblasts in purified neural cell cultures from Drosophila. Dev. Biol. 109, 184-192 (1985).
- Salvaterra, P. M., Bournias-Vardiabasis, N., Nair, T., Hou, G., Lieu, C. In vitro neuronal differentiation of Drosophila embryo cells. J. Neurosci. 7, 10-22 (1987).
- Wiemer, E. A., Wenzel, T., Deerinck, T. J., Ellisman, M. H., Subramani, S. Visualization of the peroxisomal compartment in living mammalian cells: dynamic behavior and association with microtubules. J. Cell. Biol. 136, 71-80 (1997).
- Rizzuto, R., et al. A gene specifying subunit VIII of human cytochrome c oxidase is localized to chromosome 11 and is expressed in both muscle and non-muscle tissues. J. Biol. Chem. 264, 10595-10600 (1989).
- Poot, M., et al. Analysis of mitochondrial morphology and function with novel fixable fluorescent stains. J. Histochem. Cytochem. 44, 1363-1372 (1996).
- Haller, T., Dietl, P., Deetjen, P., Volkl, H. The lysosomal compartment as intracellular calcium store in MDCK cells: a possible involvement in InsP3-mediated Ca2+ release. Cell Calcium. 19, 157-165 (1996).
