Organelle Trasporti in Colta<em> Drosophila</em> Celle: Cell Line S2 e Primaria neuroni.
Summary
Cellule di Drosophila S2 e neuroni in coltura sono grandi sistemi per l'imaging dei trasporti organello motorizzata in vivo. Qui si descrive protocolli dettagliati per la coltura di entrambi i tipi di cellule, la loro rappresentazione e analisi di trasporto.
Abstract
Cellule di Drosophila S2 placcato su un vetrino in presenza di lunghi processi ramificati forma farmaco-actina depolimerizzante pieni di microtubuli uniformemente polarizzati. Organelli si muovono lungo questi processi da motori microtubuli. Facilità di manutenzione, elevata sensibilità alla proteina RNAi mediato knock-down e procedure efficienti per la creazione di linee cellulari stabili rendere le cellule di Drosophila S2 un sistema modello ideale per studiare il trasporto merci con immagini dal vivo. I risultati ottenuti con le cellule S2 possono essere ulteriormente applicate a un sistema più fisiologicamente rilevanti: trasporto assonale nei neuroni primari in coltura da embrioni dissociate Drosophila. Neuroni in coltura crescono lunghi neuriti piene di microtubuli in bundle, molto simili ai processi S2. Come in cellule S2, organelli in neuroni in coltura possono essere visualizzate da entrambi i coloranti fluorescenti specifici per organelli o utilizzando marcatori fluorescenti organelli codificate dal DNA iniettato in embrioni precoci o espresse in transgenderic vola. Pertanto, il trasporto degli organelli può essere facilmente registrato in neuroni coltivati su vetrini utilizzando immagini viventi. Qui si descrivono le procedure per la coltura e la visualizzazione di trasporto merci in cellule di Drosophila S2 e neuroni primari. Noi crediamo che questi protocolli rendono entrambi i sistemi accessibili per i laboratori che studiano il trasporto merci.
Introduction
Cellule di Drosophila S2 hanno guadagnato crescente popolarità per studiare molti processi cellulari. Queste cellule sono stati originariamente ottenuti da trypsinized embrioni fase tardiva della OregonR Drosophila melanogaster e mantengono le caratteristiche macrofagi-like 1. Cellule di Drosophila S2 offrono molti vantaggi rispetto ad altre linee cellulari. Essi sono coltivate a 25 ° C senza CO 2, e possono essere esposte per molte ore a temperatura ambiente senza la necessità di riscaldamento o scambio di gas. Ancora più importante, le cellule di Drosophila S2 sono molto sensibili al trattamento RNAi permettendo alta efficienza knockdown di proteine di interesse. Cellule S2 sono altamente transfectable e linee cellulari stabili possono essere selezionati in meno di quattro settimane per permettere l'espressione ectopica stabile di proteine di interesse. Cellule S2 normalmente crescono sia liberamente associate, ma non si diffondono su un pallone o in sospensione. Essi possono essere indotti a diffondersi su vetrini rivestiti con una conca impianto lectinanavalin A (ConA). La periferia delle cellule spread è particolarmente sottile e quindi ideale per microscopia cellule vive. Protocolli dettagliati per coltura cellule S2, trattamento RNAi, imaging luce diretta e immunostaining possono essere trovati nel 2,3 letteratura. Il nostro laboratorio ha adottato le cellule S2 come sistema modello per studiare il trasporto merci basato microtubuli. Cellule di Drosophila S2 trattate con farmaci che depolimerizza o recide F-actina, come citocalasina D (CytoD), crescono lunghi processi pieni di microtubuli uniformemente polarizzati 4 -10, che lo rende un sistema ideale per studiare il movimento del carico lungo array microtubuli. Diversi parametri di trasporto in questi processi. (Cioè traiettorie lunghezze, velocità, direzionalità ecc) possono essere facilmente misurate utilizzando software particella di monitoraggio automatico, DiaTrack (Semasopht: http://www.microscopy.info/Organization/Details/4423; Dr . Pascal Vallotton: http://www.csiro.au/en/Organisation-Structure/Divisions/Mathematics-Informatics-and-Statistics/PascalVallotton.aspx # a4). Queste caratteristiche rendono le cellule S2 di un sistema interessante per studiare il trasporto di merci lungo i microtubuli in cellule di coltura di tessuti.
Esperienze pilota in cellule S2 può essere esteso ad un modello fisiologicamente importante di studi trasporto merci in Drosophila neuroni primari. Simili alle cellule S2, colture di neuroni da embrioni dissociate sono permeabili a piccole molecole come coloranti e inibitori, e immagini ad alta risoluzione in tempo reale di trasporto organello possono essere eseguite in neuroni a temperatura ambiente. Utilizzo di Drosophila con differenti background genetico, possiamo esaminare la funzione dei geni nei neuroni primari per KO (mutazioni genetiche perdita-di-funzione), knockdown (dsRNA iniezione o espressione) o espressione ectopica (mosche transgeniche). In particolare, la frammentazione dei filamenti di actina mediante trattamento CytoD non impedisce crescita dei neuriti, invece crescono più velocemente, e quindi possiamo studiare microtubuli dependent trasporto organello nei neuroni CytoD trattati senza l'influenza di actina Filamenti 11. Pertanto, colture neuronali primarie uniscono i vantaggi delle cellule di coltura di tessuti e volano genetica, che lo rende un ottimo sistema per studiare il trasporto di merci in un sistema fisiologico rilevante 10,12. Dal momento che diverse malattie neurodegenerative familiari potrebbero essere causati da o associate a difetti di trasporto merci (ad esempio, malattia di Parkinson 13, la malattia di Huntington 14, Morbo di Alzheimer 15,16, la Sclerosi Laterale Amiotrofica / ALS 17, HMN7B e Perry sindrome 18,19, e atassia spinocerebellare di tipo 5/SCA5 20), colture neuronali primarie possono essere utili per l'analisi degli effetti di mutazioni specifiche che causano queste malattie sul trasporto microtubuli-dipendente.
Infine, importanti proprietà di trasporto microtubuli-dipendente sono ben conservati tra i mammiferi e le mosche, ma <em> Cultura genetica e delle cellule di Drosophila è meno costoso e richiede molto tempo, giustificando l'uso di cellule in coltura di Drosophila per studiare aspetti essenziali del trasporto degli organelli in condizioni normali e patologiche.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui vi presentiamo protocolli dettagliati per studiare il trasporto di merci microtubuli-dipendente in cellule di Drosophila S2 e la cultura neurone primario. Entrambi i processi S2 e neuriti sono strutture riempito dal bundle microtubuli matrici che fungono da binari per il trasporto degli organelli.
Due strategie sono tipicamente utilizzati per organelli etichetta: trasfezione di vettori che codificano una proteina fluorescente con una sequenza-organello il targeting o la colorazi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo i membri del laboratorio Gelfand che hanno contribuito allo sviluppo di questi protocolli. Ricerca riportata in questa pubblicazione è stato sostenuto dal National Institute of General Medical Science del National Institutes of Health con il numero aggiudicazione R01GM052111 di VIG e basco Government Department of Education, dell'Università e della Ricerca con il numero award BFI-2011-295 a UdC.
Materials
| Powder Insect cell medium (Schneider’s) | Sigma | S9895 |
| Insect –Xpress medium | Fisher | BW12730Q |
| Insulin | Sigma | I6634 |
| Penicillin | Research Products International | P93000 |
| Streptomycin | Research Products International | S62000 |
| Tetracycline hydrochloride | Sigma | T7660-5G |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 |
| Concanavalin A | Sigma | C2010 |
| Cytochalasin D | VWR | IC15077105 |
| LysoTracker Red DND-99 | Molecular Probes | L7528 |
| 100 µm Cell strainer | Fisher Scientific | 22363549 |
| 25 mm Circle cover glass | VWR | 48380 080 |
| Drosophila Vials | VWR | 89092-730 |
| Disposable pellet pestles with matching microtubes | Kimble Chase | 749520-0000 |
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