早期变质插入技术昆虫飞行行为监控

Introduction

插入电极，即使附有电子系统，以昆虫为遥测记录应用，一直是在自然飞行^1，了解神经系统如何作用的主要方式。昆虫中安装或植入人工系统已经构成涉及到扰乱昆虫的自然飞行的潜在许多挑战。浅表附件或对成年昆虫人工平台外科插入是不可靠的而引起的身体引起的惯性和应力的力量插入的设备的可能的转移。表面附着或手术插入电极也容易出现由昆虫作为一种异物被拒绝。此外，植入操作需要周围的外骨骼去除鳞及桩。厚厚的角质层也需要穿透手术神经支配，可能导致抵押品组织损伤，从而与昆虫的自然飞行干扰。所有的t灰褐色的因素可以使手术或表面植入手术一个具有挑战性的和微妙的任务。为了缓解这些问题涉及外部连接的控制和传感系统，以昆虫，一种新颖的方法，涉及变质的增长将在本文中加以说明。

holometabolic昆虫的变态发育开始于幼虫（若虫或）改造成一个成年人与一个中间蛹期（ 图1）。变态过程涉及广泛的组织重新编程，包括变性后重塑。这种转型变成一个陆地幼虫到成虫演示几个复杂的行为^2,3。

极端连体手术后昆虫的生存已经证明，其中在早期变质阶段^4,5分别进行了手术。在这些手术中，发展​​组织发生喧嚣编手术伤口被修复在较短的持续时间。根据这些意见，一种新技术已经开发，其中变质增生的早期阶段（图1）中进行导电电极的植入。这使得对昆虫⁶生物力学安全依恋。高度可靠的接口也确保与昆虫的神经和神经肌肉系统^7。这种技术被称为“早期变形记插入技术”（发射^）8。

整个组织系统的重建之后，在蛹插入结构出现的成虫。飞行的肌肉群组成，以65％的总胸椎体量，因此，对于EMIT程序⁹比较方便的目标。在基本振翅的变化飞行供电dorsolongitudinal（DL）的形态和背腹（DV）肌肉造成机翼articulat离子的几何形状来产生升力^10。因此，DL和dv肌肉功能协调已经下飞行神经生理学的一个活跃的研究课题。在电子编程的视觉环境圈养昆虫一直是研究的复杂运动器官行为^11,12的神经生理学的最常用方法。发光二极管面板组成的圆柱形领域已被用于这些虚拟现实环境中，飞虫被拴在中间，其运动由动态地更新周围的全景视觉显示了模拟。在较小的昆虫，如果蝇的情况下，栓系是通过将一个金属销的昆虫的背侧胸部和放置针下的永久磁铁^13,14来实现。此方法只允许运动反应的量化，通过视觉观察用高速摄影机，没有任何电生理分析。此外，该甲基OD一直是低效的，暂停烟草天蛾的较大和较重的车身。为了解决这个问题，我们从磁磁悬浮帧，其中重量轻帧，重视他们的底部磁铁是通过电磁力悬浮受惠。当与市售神经放大器和LED阵列相结合，这提供了一个平台来控制飞行，电机输出和记录烟草天蛾的相关电。

Protocol

注意：要按照协议要求的材料和试剂的来源，在“试剂”表下面提供。

1，准备印刷电路板（PCB）的记录电极连接

注意：为了提供一个实用的实验程序，线电极被焊接到PCB上，以插入这些电极插入FFC（柔性扁平电缆）的连接器。

1. 切一个0.5x5厘米²片覆铜板的。
2. 用细尖标记，绘制三个0.1x5cm ²矩形垫，作为蚀刻掩模图案。
3. 采用通风的地方或通风橱内的印刷电路板蚀刻液蚀刻暴露层压板。覆盖叠层体的切口的长度与非反应性的胶带约1厘米。填有刻度的烧杯中与至少百毫升PCB蚀刻剂和胶带的铜层压板切口到该带刻度的烧杯用胶带的内部。铜层压板cutou的一半吨应该浸没在PCB蚀刻剂。
4. 将烧杯20分钟的旋转平台上。
5. 从蚀刻剂中取出的切口，并将其放置于充满水10分钟的烧杯中。
6. 使用纸巾，应用异丙醇和删除的标记，露出非蚀刻铜垫。
7. 大约1厘米长的切断在印刷电路板成更小的正方形。
8. 用锋利的刀片，以3厘米长度每切两片涂覆，退火，不锈钢丝（0.11“涂覆，0.008”裸）。这些片的不锈钢丝是将要被插入到昆虫的胸部的有源电极。
9. 使用刀片，从每根电线的两端去掉4-5毫米的塑料涂层。建议使用显微镜。
10. 切10.7厘米一块绝缘的不锈钢丝，以创建一个尖端延伸的接地电极。轻轻地用刀片除去包衣或用焊接红外热融化在步骤1.9的执行。
11. 对于接地连接，切一块柔性（绞合或电感器）连接至4.5厘米长。
12. 焊接0.7 cm长的步骤1.10到1.11步准备的接地连接线制不锈钢。露出的不锈钢尖端应位于接地连接的末端。
13. 用胶带将制备的电极板牢固地用非反应性胶带的焊接工作区。使用磁带来掩盖所有的焊盘，但1-2毫米的板，其中的电极将被焊接。焊盘这个蒙面，无焊接结束时将被插入到在步骤4.1中所述的FFC连接。
14. 对准三个电极布线，使得每个的一端可被焊接到电极板的相应焊盘。适用于不锈钢磁通穿过电极焊盘，以便于焊接。
15. 焊接上的每个焊盘露出的电极。
16. 浸入电极在丙酮和异丙醇中进行10分钟每次清洁锡渣。使用超声波浴的提高了清洁性能。

2，手术插入到烟草天蛾蛹

注：昆虫将是最活跃的白天和黑夜之间的转换。因此，人工昼/夜循环应该被昆虫室中使用自动定时器插座成立。这些应该被设置为模拟7小时黑暗和17小时光照周期。

1. 检查烟草天蛾蛹每天确定一个适当的插入时间。蛹是准备插入大约一天后，翅膀表现出黑斑。
2. 麻醉蛹，将它们放置在冰箱（4℃）大约为6个小时。
3. 准备插入工作区。工作区应包括异丙醇，锋利的镊子，刀片，和一个30 G注射针。作为一个选项，氰基丙烯酸酯粘合剂可用于增强电极的固定。
4. 通过浸渍成或用异丙醇擦拭消毒针头，镊子，以及电极。
5. 从冰箱中取出蛹，并将其转移到工作空间。
6. 确定对应于所感兴趣的肌肉群的胸部的位置。在这个例子中，工作的重点是负责机翼上冲程运动的背腹肌肉。
7. 使用锋利的刀片，轻轻走过exocutical层划伤一个1x1 ^平方厘米的长方形。使用镊子，慢慢撕下这些作品。
8. （可选）使用的真空，从胸部的暴露区域除去机翼的头发。
9. 慢慢地插入约5mm针头插入mesothorax所在的翅膀连接到胸部，以创建针对肌肉群的两个插入点。
10. 使用镊子，引导两个记录电极插入两个插入点。
11. （可选）要加强机械耐久性，清洁电极周围的头发并慷慨应用氰基丙烯酸酯胶粘剂在每个插入点与线式施加的胸部。
12. 准备一个笼子出现适当的材料（粗糙，质感）覆盖的墙壁和天花板，使昆虫可以在出现攀升。也可使用穿孔纸箱或包装的纸张。
13. 准备一个坚强内固定棒具有约6厘米长和直径为2毫米。塑料搅拌器，棉签，或金属丝可用于该步骤。
14. 小心地伸出长鼻下方的孔滑动这根棍子。
15. 固定在轿厢表面上，使得蛹不能滚绕杆的两侧。定位蛹笼使得mesothorax朝上的内部。广泛的移动可能会损坏电极，损耗血淋巴，或使插入无用。

3，插入接地电极进入烟草天蛾

注意：接地（参见ENCE）电极应该被插入到胸部，腹部或前端部分，以避免信号耦合。这种插入可以在蛹发育的后期阶段或后的昆虫出现来完成。用于接地电极的窗口，必须在蛹期制备为任何一个蛹或成虫期的接地电极的插入。

1. 对蛹期的插入：环绕有源电极剥离mesothoracic角质层后（参见步骤2.7），通过exocutical层划伤另一个矩形使用30 G皮下注射（约0.5x0.5厘米^2）上的背腹部靠近胸部针。使用在第2节中描述的技术将接地电极到这个窗口。
2. 对于成年阶段接地电极插入：一旦昆虫已经出现，将其放置在冰箱中4℃，6〜24小时来固定。
   剩下的步骤都是相同的两个蛹和成虫阶段插入。
3. 准备插入背板化工作空间，包括异丙醇，尖锐的镊子，一个30 G注射针，氰基丙烯酸酯胶粘剂，一段导线的应用胶水，热cauterizer（可选），和一个牙科用蜡棒（可选）。
4. 定位插入点大约1-2厘米的距离沿后腹部的记录电极。
5. 慢慢地将针头刺穿腹部，并提供一个插入位点。
6. 用镊子小心地将接地电极插入插入位点和施加压力，直到它是3-4毫米深。握住电极的地方，并使用导线应用周围的插入位点胶。
7. （可选）要提高机械强度，使用温度cauterizer，并在尖端收集蜡的小（2-3毫米）珠。将吸头接近插入位点和施加热，使得蜡围绕电极和牢固地保持在适当位置。

4，准备适配器董事会

ontent“>注：适配器板需要通过FFC（柔性扁平电缆）连接器的电极板连接到无线录像探头对于这一点，类似于电极板一个板需要通过以下准备步骤1.1至1.7 。

1. 焊接一个FFC连接到所制备的板的一端。
2. 焊接3 30 AWG（美国线规）接上电线的另一端​​三个垫片。
3. 焊接小三接头为下一阶段描述的三个焊盘上的适配板示波器读数。
4. 焊接的这些三根导线的另一端​​连接到探头连接器。
5. 固定探头电路板的悬浮框的顶部。

5，用示波器（可选）预录

注：为了评估该电极的可靠性和观察信号的信噪比，拴示波器记录可以部署WIREL之前获得ESS的记录系统。应该用于此在适配器板上的微型导线连接器。

1. 将示波器连接到细胞外的神经录音放大器。设置放大器参数为1赫兹，20 kHz的低通截止频率，和100的增益的高通截止频率。
2. 每个在转接板上，女迷你导线连接器连接到放大器的输入通道。
3. 从笼子里植入电极板上卸下昆虫，当它处于活动状态（在它的黎明时间）。将一片纸巾昆虫在为它测量前休息。
4. 使用镊子，在转接板上滑动电极板插入FFC受体。观察一个平坦和低电压基准，当昆虫是休息和肌电图（EMG）的产生尖峰昆虫扇动它的翅膀。
   注：请参阅第6章：观察昆虫飞行的无线录音系统representat香港专业教育学院示波器结果。
5. 根据需要调整示波器观察参数。捕获数据在示波器上并保存数据。

6，观察昆虫飞行的无线录音系统

注意：一个电磁悬浮平台可以为肌电信号的无线录音期间拴烟草天蛾飞行建成。该磁悬浮平台由设计来平衡一个圈养机制框架。悬浮允许的帧，因此，昆虫，在测试过程中偏航无束缚的电线的约束。该框架可以使用熔融沉积成型（FDM）的机器快速原型。磁铁需要被安装到该框架，以通过一系列的磁铁在基座平台被悬浮的底部。昆虫被连接到悬挂在框架的顶部的FFC连接。该磁悬浮平台位于这是构建加兹登LED的竞技场内克60板的5x7个别LED阵列组成。该系统是基于对苍蝇^15，16，17开发的水果视觉刺激的环境中建立的方法。竞技场由微控制器允许模拟顺时针和逆时针旋转以及旋转速度的控制的控制。

1. 由探头连接到适配器板连接器悬浮平台上设置无线记录系统。
2. 从笼中取出的昆虫，当它处于活动状态时它的黎明时间最好。
3. 使用镊子，小心将电极板插入磁悬浮框架，使昆虫被安装在牢固悬挂在FFC受体。
4. 将磁棒上的探头的磁性接近开关来激活无线数据传输。蓝色指示灯将亮起，表明探头处于活动状态。
5. 关掉的灯房间完全黑暗。一个红色的指示灯，可以用来添加灯光的房间。在电脑上打开遥测数据采集软件，并选择适当的预加载的配置文件，如果有的话。启动数据采集开始观看的信号。
6. 选择用于观察的EMG信号的无线记录系统上的相应的用户界面，以确保可靠的无线连接和电极的操作。
7. 打开所有的灯竞技场组成部分：直流稳压电源和微控制器。微控制器可以调整每个循环的光图案的微小的旋转，也可以控制光的旋转方向。
8. 竞技场内慢慢平衡磁悬浮平台。上面仔细地悬浮底座中心的框架，否则该帧将被迅速拉至地面可能伤及昆虫对齐。
9. 启动视频记录系统。
10. 选择该软件的相关记录片接口。指定录音时间和文件保存的目的地。选择合适的输出设置，以保存数据。单击开始按钮来启动该软件中记录会话。这将节省可以被导入到数值计算环境中的数据文件。
11. 观察的昆虫苍蝇在与该LED的移动对应的方向。反向LED的方向，并确认昆虫反转方向。随意执行此多次。

Representative Results

整体EMIT过程的示意图示于图1中 ，示出了在天蛾的变质周期和相应的电极插入步骤的主要阶段。电极插入应该在后期蛹期羽化前4-7天进行。这使得肌纤维开发围绕电极和固定在植入物中的昆虫。

一个完成后期蛹期的插入已经插入两个活性电极和接地电极，其中的典型结果示于图2。

已完成的成年阶段插入已经插入两个活性电极和接地电极，其中的典型结果示于图3。

在LED舞台用于诱导在飞行过程中的烟草天蛾转动示于图4，一种微控制器瓦特作为编程以允许在LED阵列垂直图案的旋转速度的控制。角速度的LED图案被设置为每秒7.3度。磁悬浮平台被安排在LED的舞台的中心，使昆虫以自由转动响应于所述LED阵列。

图5显示了前，后翅拍打的背腹肌肉示波器采集肌肉电位信号。在信号已被处理以100倍的放大和1赫兹的高通滤波器和20kHz的低通滤波器。在静止期间，没有肌肉电位观察。在扑翼的肌肉电位发生在大约15 Hz至20Hz的。

图6显示了前，后翼扑收购与无线仪表的肌肉电位信号。在静止期间，没有肌肉电位观察。肌肉电位DURING翼拍动发生在大约15Hz的 - 20赫兹。

图1。EMIT程序。上烟草天蛾进行EMIT程序的示意图，在协议中说明。

图2。蛹插入。晚期蛹用EMIT插入记录电极后的照片。

图3。蛾的出现。成年蛾植入记录的照片一个电极折后羽化。

图4。录像设置的磁悬浮平台和舞台上的LED用于从烟草天蛾飞行肌记录肌电图信号。这里一个烟草天蛾 ，响应于所述旋转LE图案执行偏航机动。

图5。示波器肌电图。使用放大器和示波器一个背腹肌肉的2.5秒肌电图记录。

图6。无线肌电图。1.9秒肌电图记录使用无线探头记录单元和数据采集软件的背腹肌肉。

Discussion

有许多影响在后续步骤中的协议的记录数据的功能的记录电极的外科插入过程中几个关键步骤。记录电极应插入蛹1天参展翼点在其背侧之后。如果这个时间之后两天或两天以上进行插入，昆虫的组织将没有足够的时间来开发和周围稳定插入电极。这可能导致在成年阶段的植入电极和不可靠的记录的动作。

不插入记录电极成蛹飞行肌在超过5毫米的深度是重要的。否则，血淋巴将退出的插入点，并导致较弱的飞行肌的发育。如果血淋巴没​​有出现，停止程序，并允许蛹24小时，试图再次插入电极之前恢复。插入部位应清洁日各翼头发oroughly前电极被插在蛹。这可以防止头发进入插入孔和与该电极组织界面发生干涉。

为了确保最佳的机翼健康的成年蛾，插入部位应使用镊子重新清洗的翼毛羽化前一天。此外，它是推荐使用镊子松开角质层窗口被切开的皮下注射针头，以协助在次日发生羽化的边缘。如果有任何胶水或血淋巴已接近角质层窗口的边缘干燥处，防蛀将无法羽化后膨胀的翅膀，这个标本不会对实验很有用。

虽然插入时间以天为单位给出，这些可能会略有不同的变质发展的时间表是饲养温度为变温动物的功能。所提供的天是昆虫饲养在RT中。如果一个标准25°，C的养虫孵化器被使用时，发展速度会更快约为10-20％，而插入时间需要进行相应的调整。

本研究的限制将引入到设定的快速成型ABS塑料悬浮框的转动惯量。该帧的质量可高达〜200克，而蛾的质量为约4克。用一个电磁浮起帧的好处是在框架和支撑结构之间的摩擦接触的损失。然而，使用相对较重的框架使昆虫耗费更多的能量来完成偏航操纵响应于所述旋转LED图案。的修改，在此研究中使用的系栓帧可以使用密度较低的材料和/或建立一个较薄的帧来降低惯性负荷。

变态过程中的发展变化带来的新功能，神经工程的方法来学习如何昆虫飞。这是一个显着的观察，在蛹期结果在减轻组织反应相对于成年阶段插入电极插入。因此，生成一个基于插入确保机械连接合成系统或昆虫的同时，实现对昆虫的运动器官的行为最少的短期影响可预测的神经肌肉接口。在过去的二十年里，robotists工作在非常小规模的无人驾驶飞行器，灵感来自昆虫飞行。超越使得一种新的电生理技术，EMIT程序还允许昆虫机接口（IMI），其可以提供对昆虫控制其感觉和行为生理学⁸的电兴奋细胞进入神经 ​​工程师。这有可能为“biobotically”驯服和控制昆虫运动。因此，在本文中给出的具体方法不仅可用于研究昆虫飞行，同时也为驯化的昆虫混合动力厘米级飞行biobots ^18。这种混合式平台的一个应用是对昆虫转换成移动环境传感系统。这些工作动物有可能帮助人类通过收集和存储环境信息监测合作共享的生态系统。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Coated stainless steel wire	A-M Systems	791900	0.008’’ bare, 0.011’’ coated, annealed
Flexible electrode wire			Litz or inductor wire can be used.
Surface-mount FFC connector	Hirose Connector	FH28E-20S-0.5SH(05)
Tweezers	Grobet USA		Clean with 70% alcohol before use on the insect.
Kim-Wipes	Kimberly-Clark Worldwide	34155	Any size delicate-wipe tissues can be used.
Teflon tape			5 mm width Teflon tape.
Hypodermic Needle	Becton Dickinson & Co.	30511	20-30 G hypodermic needle can be used. Video showed 30 G.
Rigid fixation stick			Variety of materials can be used (e.g., coffee stirrers)
Insect emergence cage			Plastic pet cage lined with packing paper or similar padding. Ventilation holes are needed.
Thermal cauterizer	Advanced Meditech International	CH-HI CT2103 (tip)	Optional equipment used for application of dental wax.
Dental wax	Orthomechanics LC., Broken Arrow, Oklahoma		Optional material used for stabilizing the electrodes on the insect.
Magnetic levitation platform			Custom designed frame fabricated in-house with 3D prototyping.