JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
생체공학

تحسين طريقة لإعداد القائم على الخليوي، الاتصال نموذج الإنسان من حاجز الدم في الدماغ

Published: November 12, 2013
doi:
10.3791/50934
,
1Australian Centre for Blood Diseases,Monash University

Summary

إنشاء نماذج الإنسان من حاجز الدم في الدماغ (BBB) ​​يمكن أن تستفيد من البحث في الظروف الدماغ المرتبطة فشل BBB. نحن هنا وصف تقنية محسنة لإعداد نموذج BBB الاتصال، والذي يسمح coculturing من الخلايا النجمية والخلايا البطانية الإنسان الدماغ على طرفي نقيض من غشاء يسهل اختراقها.

Abstract

وتضم حاجز الدم في الدماغ (BBB) ​​الشعيرات الدموية في الدماغ ولكن غير منفذة للتكيف التي تتحكم بإحكام البيئة الدماغ. وقد ضمنا فشل BBB في مسببات العديد من الأمراض في الدماغ، وخلق الحاجة إلى تنمية الموارد البشرية في نماذج BBB المختبر للمساعدة في البحوث ذات الصلة سريريا. من بين العديد من النماذج BBB صفها حتى الآن، وهو ثابت (بدون تدفق)، اتصل BBB النموذج، حيث يتم cocultured الخلايا النجمية والخلايا البطانية الدماغ (BECS) على طرفي نقيض من غشاء يسهل اختراقها، برزت تبسيط النظام حتى الآن لمحاكاة أصيلة BBB مع قدرة إنتاجية عالية الفرز. مع ذلك الجيل من هذا القبيل نموذج تحديات التقنية قليلة. هنا، نحن تصف بروتوكول لإعداد BBB نموذج الاتصال البشري باستخدام تركيبة جديدة من BECS الإنسان الأولية والخلايا النجمية الإنسان خلد. على وجه التحديد، ونحن من التفصيل طريقة مبتكرة لخلية البذر على إدراج مقلوب وكذلك تحديد INSERتقنيات تلطيخ ر ومثالا كيف نستخدم نموذجنا للبحوث المتعلقة BBB-.

Introduction

بي بي بي هي واجهة المتخصصة بين الدورة الدموية الطرفية والجهاز العصبي المركزي، والمسؤولة بشكل حاسم للحفاظ على الارقاء الدماغ. ويضم خلايا الدماغ متميزة البطانية الاوعية الدموية الدقيقة (BECS) والتي تتأثر وظيفيا من قبل عدد قليل من المكونات الخلوية وديكي (أدناه) لتشكيل بوابة ضيقة والحيوية في الدماغ. في ظل الظروف الفسيولوجية وBBB يقيد مرور خلايا الدم، مكونات البلازما والمواد الضارة، وكلها يمكن أن تكون أعصاب، إلى الدماغ. في موازاة ذلك، BBB يتبادل انتقائي الأيونات والمواد المغذية (الجلوكوز والأحماض الأمينية) الأساسية ومنتجات النفايات الأيضية بين الدماغ والدورة الدموية للحفاظ على البيئة بدقة 1،2 الدماغ. في السنوات الأخيرة هو أنه أصبح واضحا أن فشل BBB يحدث في مجموعة متنوعة من الأمراض المزمنة في المخ، مثل الأمراض العصبية أو ذات الصلة التهابات (مثل مرض الزهايمر وmultiplه التصلب، على التوالي) 3، وكذلك في الحالات الحادة مثل السكتة الدماغية 4.

وبفعل خصائص فريدة من نوعها BBB من الخلايا البطانية في الدماغ (BECS) إلى حد كبير البيئة الدماغي على 5، وعلى وجه الخصوص من قبل الخلايا النجمية 6،7. هناك فهم متزايد بأن غيرها من أنواع الخلايا، مثل pericytes 8، الخلايا العصبية والخلايا الدبقية الصغيرة 1،3، فضلا عن الغشاء القاعدي 9، ودعم BECS وتشكل معا وحدة وظيفية تسمى "وحدة وعائية عصبية" (NVU) والتي في وقت واحد الأزواج العصبية مطالب الأيضية إلى الشعيرات الدموية التي تزود 10.

إشراك BBB في حالات المرضية وراء العديد من المحاولات لتطوير في نماذج BBB المختبر للمساعدة في البحوث المتعلقة BBB-11،12. تهدف هذه النماذج إلى تقليد أقرب مكان ممكن في الجسم الحي خصائص BBB وفقا لمبدأ NVU. في المختبر </م> نماذج BBB تعتمد عموما على أحادي الطبقة من BECS تشكيل ضيق تقاطع (أساسا من الأبقار 13، الإنسان 14، 15 الفئران، والماوس 16، والخنازير 17،18 أصول)، مثقف على غشاء يسهل اختراقها مع الخلايا النجمية دعم (على نطاق واسع مراجعتها من قبل ديلي وآخرون 2005 11).

يمكن زراعتها الخلايا النجمية في ظروف عدم الاتصال على الجزء السفلي من نسيج الثقافة جيدا، وفصلها عن BECS (المزروعة على السطح العلوي للغشاء) من مستنبت بعد التواصل مع BECS عبر العوامل القابلة للذوبان 16. في نماذج أكثر تقدما والتي تشبه أفضل بنية التشريحية للBBB في الجسم الحي، تتم المحافظة على الخلايا النجمية في ظروف الاتصال ومثقف مباشرة على الجانب الآخر من الغشاء على مقربة من BECS 13،15،17 (الشكل 1). هذا التكوين يتيح الاتصال الجسدي بين BECS والخلايا النجمية، التي أنشئت عندما مشروع النجميةعملياتها من خلال غشاء يسهل اختراقها. الأهم من ذلك، لجهة اتصال وفيا لتحدث المسام ينبغي ≥ 1μm في القطر، ومنذ نهاية نجمي قدم لا يمكن أن تمر من خلال المسام أحجام أصغر (أي 0.4 ميكرون) 14،15. وخاصة، وأثبتت أنظمة الاتصال BBB في بعض الدراسات لتكون متفوقة على نظيراتها عدم الاتصال بهم بشأن مقاومتهم عبر البطانية الكهربائية (طير) والقيم نفاذية البطانية من مختلف استشفاف 13،17،18. وأضاف بعدا إضافيا من تدفق وسائل الاعلام مؤخرا في عدد من نماذج في المختبر BBB لتطبيق قوى القص إلى البطانة لمحاكاة أقرب من الأوعية الدموية في الدماغ 12،19.

واحدة للتغلب على عقبة الفنية عند إنشاء نموذج الاتصال BBB هو البذر من الخلايا النجمية ضد الجاذبية على سطح مجافي اللمعة للغشاء يسهل اختراقها. البروتوكولات السابقة 13،20، حيث كانت المصنفة الخلايا النجمية ببساطة في قطرة من وسائل الاعلام على رأس من فيإدراج verted، سمحت مرات البذر قصيرة فقط (أي 10 دقيقة أو 13 ساعة 2 20) والتي تم العثور عليها في أيدينا غير كافية لمرفق الخلايا السليمة. باستخدام هذه الطريقة الأساسية، وهي فترة أطول مرفق نجمية يتطلب مراقبة مستمرة من قبل إدراج افتتاح متكررة من الحاضنة (يسبب تقلبات في درجة الحرارة، ودرجة الحموضة والرطوبة)، وأيضا عرضة للبذر الخلية متفاوتة بسبب تسرب سائل الإعلام من خلال المسام، وخاصة إذا يعملون المسام أكبر من 1 ميكرون.

هنا، نحن تصف بروتوكول العامة لإعداد نموذج الاتصال BBB. ويشمل الإجراء لدينا طريقة بديلة لخلية البذر على إدراج المقلوب، الذي يتناول القيود المذكورة أعلاه. يسمح أسلوب الالتزام دون عائق من الخلايا النجمية على سطح غشاء مجافي اللمعة، في حاضنة معايرتها، لفترة ممتدة من الزمن. ونتيجة لذلك، يتم التوصل إلى بذر موحدة من الخلايا النجمية مما يزيد جودة حاجزويقلل من الاختلافات بين نفاذية القاعدية إدراج.

مثل استخدام الخلايا البشرية من المهم للبحوث ذات الصلة الإنسان 21، علينا أن نظهر في هذه المقالة بالإضافة إلى استخدام محددة من تركيبة جديدة من BECS الإنسان الابتدائية وخلدت الخلايا النجمية الإنسان لإنشاء BBB نموذج الاتصال البشري مع قدرة عالية الإنتاجية الفرز . منذ عرض من الخلايا في أغشية مسامية يمكن أن يكون صعبا، ونحن أيضا تقنيات تلطيخ التفاصيل التي يمكن أن تساعد في تحديد نقطة التقاء ومورفولوجيا الخلايا على أغشية مسامية. أخيرا، ونحن مثالا كيف يمكن استخدام لدينا نموذج BBB الإنسان لدراسة تأثير الأنسجة من نوع منشط البلازمينوجين (ر-PA) – جلطة خرق انزيم التي هي بمثابة الخيار الوحيد لعلاج السكتة الدماغية الحادة – على BBB.

Protocol

1. الثقافة الخلية (3-7 أيام قبل الجمعية BBB) 1.1. الأولية خلايا الدماغ البشري البطانية الاوعية الدموية الدقيقة (BECS) تم الحصول عليها تجاريا BECS. تم إنتاج الخلايا عن طريق التفكك dispase من الأنسجة الطبيعية ق?…

Representative Results

من أجل إنشاء الإنسان، نموذج الاتصال BBB كان علينا أن زراعة SVGs وBECS على الأغشية التي يسهل اختراقها مع 3 ميكرون مسام الحجم، كما هو موضح للسماح بمرور نجمية نهاية القدمين للاتصال مع الخلايا البطانية 14،15،27،28. ويتضح تمثيل التخطيطي للنموذج الاتصال كاملة في الشكل 1</st…

Discussion

الأبحاث الطبية في أمراض الدماغ يعاني صعوبة كبيرة متعدية. في مجال السكتة الدماغية الحادة، على سبيل المثال، العديد من الأدوية التي أظهرت وعدا كبيرا في النماذج الحيوانية فشلت في العيادة 38،39. أسباب هذه النتائج المخيبة للآمال متنوعة وتشمل الخيانة من أنظمة الاختبا?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وقد تم تمويل هذه الدراسة من المنح التي منحت لRLM من المجلس الوطني للصحة والبحوث الطبية في استراليا (منحة # 606658).

Materials

Attachment Factor Cell-Systems Corporation 4Z0-210
Brain microvascular endothelial cells (BECs), primary, human Cell-Systems Corporation ACBRI 376
Complete medium Cell-Systems Corporation 4Z0-500 Supplemented with CSC JetFuel
Complete serum-free medium Cell-Systems Corporation SF-4Z0-500 Supplemented with CSC RocketFue
DMEM/F-12 with 15 mM HEPES Life Technologies 11330-032
Endothelial cells growth supplement (from bovine origin) Sigma-Aldrich E2759-15MG
External silicone tubing Watson-Marlow 913.A080.016 Pumpsil brand, 8 mm internal diameter, 1.6 mm wall
Foetal calf serum Lonza 14-501F
Gentamycin sulfate Life Technologies 15750-060
Heparin sodium Pfizer 1,000 U/ml
Hexamethyldisilazane (HMDS) Sigma-Aldrich H4875
Human brain microvascular endothelial cells Cell-Systems Corporation ACBRI 376
Internal silicone tubing Watson-Marlow 913.A032.016 Pumpsil brand, 3.2 mm internal diameter, 1.6 mm wall
L-Glutamine Life Technologies 25030
Mayer’s hematoxylin solution Amber Scientific MH
Minimum essential medium with Earle’s balanced salt solution HyClone Laboratories SH30244.01
Penicillin/Streptomycin Life Technologies 15140
Rat collagen I Trevigen 3440-100-01 Cultrex brand
Tissue culture inserts Corning Life Sciences 3472 Transwell brand, 6.5 mm in diameter, with polyester porous membrane, 3 µm pore-size

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hawkins, B. T., Davis, T. P. The blood-brain barrier/neurovascular unit in health and disease. Pharmacol. Rev. 57, 173-185 (2005).
  2. Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiol. Dis. 37, 13-25 (2010).
  3. Zlokovic, B. V. The blood-brain barrier in health and chronic neurodegenerative disorders. Neuron. 57, 178-201 (2008).
  4. Vivien, D., Gauberti, M., Montagne, A., Defer, G., Touze, E. Impact of tissue plasminogen activator on the neurovascular unit: from clinical data to experimental evidence. J. Cereb. Blood Flow Metab. 31, 2119-2134 (2011).
  5. Stewart, P. A., Wiley, M. J. Developing nervous tissue induces formation of blood-brain barrier characteristics in invading endothelial cells: a study using quail–chick transplantation chimeras. Dev. Biol. 84, 183-192 (1981).
  6. Janzer, R. C., Raff, M. C. Astrocytes induce blood-brain barrier properties in endothelial cells. Nature. 325, 253-257 (1987).
  7. Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nat. Rev. Neurosci. 7, 41-53 (2006).
  8. Dalkara, T., Gursoy-Ozdemir, Y., Yemisci, M. Brain microvascular pericytes in health and disease. Acta Neuropathol. 122, 1-9 (2011).
  9. Engelhardt, B., Sorokin, L. The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction. Semin. Immunopathol. 31, 497-511 (2009).
  10. Girouard, H., Iadecola, C. Neurovascular coupling in the normal brain and in hypertension, stroke, and Alzheimer disease. J. Appl. Physiol. 100, 328-335 (2006).
  11. Deli, M. A., Abraham, C. S., Kataoka, Y., Niwa, M. Permeability studies on in vitro blood-brain barrier models: physiology, pathology, and pharmacology. Cell. Mol. Neurobiol. 25, 59-127 (2005).
  12. Booth, R., Kim, H. Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (muBBB). Lab Chip. 12, 1784-1792 (2012).
  13. Gaillard, P. J., et al. Establishment and functional characterization of an in vitro model of the blood-brain barrier, comprising a co-culture of brain capillary endothelial cells and astrocytes. Eur. Pharm. Sci. 12, 215-222 (2001).
  14. Hurwitz, A. A., Berman, J. W., Rashbaum, W. K., Lyman, W. D. Human fetal astrocytes induce the expression of blood-brain barrier specific proteins by autologous endothelial cells. Brain Res. 625, 238-243 (1993).
  15. Demeuse, P., et al. Compartmentalized coculture of rat brain endothelial cells and astrocytes: a syngenic model to study the blood-brain barrier. J. Neurosci. Methods. 121, 21-31 (2002).
  16. Coisne, C., et al. Mouse syngenic in vitro blood-brain barrier model: a new tool to examine inflammatory events in cerebral endothelium. Lab. Invest. 85, 734-746 (2005).
  17. Cohen-Kashi Malina, K., Cooper, I., Teichberg, V. I. Closing the gap between the in vivo and in vitro blood-brain barrier tightness. Brain Res. 1284, 12-21 (2009).
  18. Kroll, S., et al. Control of the blood-brain barrier by glucocorticoids and the cells of the neurovascular unit. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1165, 228-239 (2009).
  19. Cucullo, L., et al. Immortalized human brain endothelial cells and flow-based vascular modeling: a marriage of convenience for rational neurovascular studies. J. Cereb. Blood Flow Metab. 28, 312-328 (2008).
  20. Li, G., et al. Permeability of endothelial and astrocyte cocultures: in vitro blood-brain barrier models for drug delivery studies. Ann. Biomed. Eng. 38, 2499-2511 (2010).
  21. Antonic, A., Sena, E., Donnan, G., Howells, D. Human In Vitro Models of Ischaemic Stroke: a Test Bed for Translation. Transl. Stroke Res. 3, 306-309 (2012).
  22. Major, E. O., et al. Establishment of a line of human fetal glial cells that supports JC virus multiplication. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 1257-1261 (1985).
  23. Eugenin, E. A., Berman, J. W. Chemokine-dependent mechanisms of leukocyte trafficking across a model of the blood-brain barrier. Methods. 29, 351-361 (2003).
  24. Dehouck, M. P., et al. Drug transfer across the blood-brain barrier: correlation between in vitro and in vivo models. J. Neurochem. 58, 1790-1797 (1992).
  25. Perriere, N., et al. Puromycin-based purification of rat brain capillary endothelial cell cultures. Effect on the expression of blood-brain barrier-specific properties. J. Neurochem. 93, 279-289 (2005).
  26. Niego, B., Samson, A. L., Petersen, K. U., Medcalf, R. L. Thrombin-induced activation of astrocytes in mixed rat hippocampal cultures is inhibited by soluble thrombomodulin. Brain Res. 1381, 38-51 (2011).
  27. Ma, S. H., Lepak, L. A., Hussain, R. J., Shain, W., Shuler, M. L. An endothelial and astrocyte co-culture model of the blood-brain barrier utilizing an ultra-thin, nanofabricated silicon nitride membrane. Lab Chip. 5, 74-85 (2005).
  28. Niego, B., Freeman, R., Puschmann, T. B., Turnley, A. M., Medcalf, R. L. t-PA-specific modulation of a human BBB model involves plasmin-mediated activation of the Rho-kinase pathway in astrocytes. Blood. , (2012).
  29. Deli, M. A., Abraham, C. S., Niwa, M., Falus, A. N,N-diethyl-2-[4-(phenylmethyl)phenoxy]ethanamine increases the permeability of primary mouse cerebral endothelial cell monolayers. Inflamm. Res. 52, 39-40 (2003).
  30. Su, E. J., et al. Activation of PDGF-CC by tissue plasminogen activator impairs blood-brain barrier integrity during ischemic stroke. Nat. Med. 14, 731-737 (2008).
  31. Yepes, M., et al. Tissue-type plasminogen activator induces opening of the blood-brain barrier via the LDL receptor-related protein. J. Clin. Invest. 112, 1533-1540 (2003).
  32. Abu Fanne, R., et al. Blood-brain barrier permeability and tPA-mediated neurotoxicity. Neuropharmacology. 58, 972-980 (1016).
  33. Wang, X., et al. Lipoprotein receptor-mediated induction of matrix metalloproteinase by tissue plasminogen activator. Nat. Med. 9, 1313-1317 (2003).
  34. Wang, X., et al. Mechanisms of hemorrhagic transformation after tissue plasminogen activator reperfusion therapy for ischemic stroke. Stroke. 35, 2726-2730 (2004).
  35. Donnan, G. A., et al. How to make better use of thrombolytic therapy in acute ischemic stroke. Nat. Rev. Neurol. 7, 400-409 (2011).
  36. Acheampong, P., Ford, G. A. Pharmacokinetics of alteplase in the treatment of ischaemic stroke. Expert Opin. Drug Metab. Toxicol. 8, 271-281 (2012).
  37. Derex, L., Nighoghossian, N. Intracerebral haemorrhage after thrombolysis for acute ischaemic stroke: an update. J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry. 79, 1093-1099 (2008).
  38. Garber, K. Stroke treatment–light at the end of the tunnel. Nat. Biotechnol. 25, 838-840 (2007).
  39. Liebeskind, D. S. Reversing Stroke in the 2010s. Stroke. 40, 3156-3158 (2009).
  40. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB J. 19, 1872-1874 (2005).
  41. Song, L., Pachter, J. S. Culture of murine brain microvascular endothelial cells that maintain expression and cytoskeletal association of tight junction-associated proteins. In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim. 39 (2003), 313-320 (2003).
  42. Steiner, O., Coisne, C., Engelhardt, B., Lyck, R. Comparison of immortalized bEnd5 and primary mouse brain microvascular endothelial cells as in vitro blood-brain barrier models for the study of T cell extravasation. J. Cereb. Blood Flow Metab. 31, 315-327 (2011).

Tags

Blood-brain BarrierIn Vitro ModelContact ModelPrimary Human Brain Endothelial CellsImmortalized Human AstrocytesCell CultureCell-seedingResearch Applications

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Niego, B., Medcalf, R. L. Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier. J. Vis. Exp. (81), e50934, doi:10.3791/50934 (2013).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image