人間の細胞に基づく、血液脳関門の接触モデルの作製のための改善された方法

Summary

血液脳関門（BBB）のヒトモデルの確立は、BBBの障害に関連する脳条件の研究に利益をもたらすことができる。ここでは、多孔質膜の両側に、ヒト星状細胞および脳内皮細胞の共培養を可能に接触BBBモデルを調製するための改善された技術が記載されている。

Abstract

血液脳関門（BBB）は、しっかりと脳環境を制御する不透過性はなく適応脳毛細血管を含む。 BBBの障害は、臨床的に関連の研究を助けるために、インビトロ BBBモデルにおいてヒトの開発の必要性が生じ、多くの脳の病態の病因に暗示されている。これまでに説明した数々のBBBモデル、（フローなし）静的な中では、星状細胞および脳内皮細胞（BECは）は、多孔質膜の両側に共培養されたBBBモデルを連絡し、シミュレートするために、簡略化され、まだ本格的なシステムとして登場ハイスループットスクリーニング能力を有するBBB。それにもかかわらず、このようなモデルの生成は、いくつかの技術的な課題を提示。ここでは、一次ヒトBECはと不死化ヒトアストロサイトの新規な組み合わせを利用したコンタクト人間BBBモデルの製造のためのプロトコルを記述します。具体的には、詳細な反転インサート上の細胞播種のための革新的な方法だけでな​​く、inserを指定T染色技術と、我々は、BBB関連の研究のための我々のモデルをどのように使用するかを例示している。

Introduction

BBBは、末梢血液循環および脳止血の維持に決定的に責任が中枢神経系との間の特殊なインタフェースである。それは、機能的に脳内にしっかりと動的ゲートウェイを形成するために（下記参照）、いくつかの細胞性および無細胞成分によって影響される別個の脳微小血管内皮細胞（前記下部電極）を含む。生理的条件下でBBBは、脳内に、血液細胞、血漿成分と有害物質、すべての潜在的に神経毒性の通過を制限する。並行して、BBBを選択的に脳および脳正確に環境^を維持するために^、1,2の循環の間にキーイオンおよび栄養素（グルコースおよびアミノ酸）および代謝老廃物を交換する。近年、BBBの障害が神経変性または炎症関連疾患（ 例えば、アルツハイマー病およびmultiplのような慢性の脳の病理の多様で起こることが明らかになってきているEは³だけでなく、虚血性脳卒中⁴のような急性状態で）それぞれ硬化症。

脳内皮細胞（BECは）の固有のBBB特性は、主にそれらの脳環境⁵によって誘導され、特にアストロサイト^6,7によってれる。これと同時に「神経血管装置」（NVU）と呼ばれるような周皮^8、ニューロンとミクログリア^1,3だけでなく、基底膜^9、サポートBECはなどの他の細胞型、という機能ユニットを一緒になって成長して理解することがありますカップル彼らの供給毛細血管¹⁰への神経代謝要求。

病理学的状況でのBBBの関与は、BBB関連の研究^11,12を支援するためにin vitro BBBモデルで開発する多くの試みの下にある。これらのモデルは、NVU原理に従って生体 BBB特性にできるだけ近くを模倣することを目指しています。 インビトロ </EM> BBBモデルは、一般的に（、（主に牛¹³から、人間の^14、ラット^15、マウス^16、およびブタ^17,18起点）タイトジャンクションを形成する前記下部電極の単層上に多孔質膜上で培養し、一緒支えるアストロサイトに依存して広範囲にデリら 2005 ^11）によって検討。

星状細胞は、培養培地がまだ可溶性因子を介して前記下部電極¹⁶と通信することによって、（膜の上面上で培養）前記下部電極から分離されたウェルの組織培養の底面上に非接触状態で増殖させることができる。より良い生体内で BBBの解剖学的構造に似ている、より高度なモデルでは、アストロサイトが直接前記下部電極^13,15,17（ 図1）に近接した膜の反対側に接触条件で培養で維持されています。この構成は、確立され、前記下部電極とアストロサイトとの間の物理的な接触を可能にするときアストロサイトプロジェクト多孔質膜を通って、そのプロセス。アストロサイトのエンドフィートは小さい細孔サイズ（ すなわち 0.4ミクロン^）14,15を通過することができないため、重要なのは、発生する真の接触のための細孔は、直径1μmのを≥必要があります。注目すべきことに、コンタクトBBBシステムは、それらの経内皮電気抵抗（TEER）および種々のトレーサー^13,17,18の内皮透過性値に関して、それらの非接触型対応物よりも優れていることがいくつかの研究で実証されている。メディアフローの追加の次元が最近、脳血管系^12,19の近いシミュレーションに内皮にせん断力を加えるためのin vitro BBBモデルの数に追加されました。

コンタクトBBBモデルを生成する際に克服する一つの技術的な障害は、多孔質膜の反管腔側表面上の重力に抗して星状細胞の播種である。アストロサイトは、単に内の一番上のメディアの落下に播種した前回のプロトコル^13,20、verted挿入、許される唯一の短い播種回適切な細胞の付着のためには不十分であることが私たちの手で発見された（ すなわち 、10分¹³または2時間^20）。この基本的な方法を用いて、より長いアストロ装着期間は、特に、（温度、pH、湿度の変動を引き起こす）​​インキュベーターの頻繁な開口部によってインサートの常時監視を必要とし、また、孔を通る媒体の漏れに起因する不均一な細胞播種する傾向がある細孔場合が1μmよりも大きいが使用される。

ここでは、コンタクトBBBモデルの製造のための一般的なプロトコルを記載している。我々の手順は、上述の制限に対処反転インサート上の細胞播種のための代替の方法を含む。この方法は、長時間にわたって、平衡化したインキュベーター中、反管腔側膜表面上への星状細胞の乱されない付着を可能にする。その結果、星状細胞の均一な播種は、バリア品質を向上が達成されると挿入の間、基礎透過性の変動を最小限に抑えることができます。

ヒト細胞の使用は、人間が関連する研究²¹のために重要であるとして、我々は、さらに、この記事で初代ヒトBECは、新規な組み合わせの具体的な利用を実証し、ハイスループットスクリーニング能力との接触人間BBBモデルの確立のための人間のアストロサイトを不死化。多孔性膜上に細胞を観察すると、多孔質膜上に合流し、細胞形態の決定を補助することができる困難で、また我々の詳細を染色技術とすることができるからである。 BBB上 – 急性虚血性脳卒中のための唯一の治療選択肢となって血栓破裂酵素 – 最後に、私たちは私たち人間のBBBモデルは、組織型プラスミノーゲン活性化因子の影響（T-PA）を調べるために利用することができる方法の例である。

Protocol

1。細胞培養（前はBBB総会に3〜7日） 1.1。初代ヒト脳微小血管内皮細胞（BECは） BECは、商業的に入手した。細胞を、正常なヒト脳皮質組織のディスパーゼ解離によって生成され、通路3（<12回の集団倍加）で凍結提供された。 基層 ：メーカーの指示に従って「接着因子」とコート組織培養容器。 細胞の維持 ：血清含有?…

Representative Results

人間を確立するために、BBBモデルに連絡し、我々は、内皮細胞14,15,27,28と接触するアストロサイトのエンドフィートの通過を可能にするために示され、3ミクロンの細孔径を有する多孔質膜上SVGsと前記下部電極を育成しなければならなかった。完全な接触モデルの概略図を図1（図示の左側）に示されている。コンタクトシステムによって提示された主要な技術的な課題は?…

Discussion

脳の病理への医学研究は、多くの翻訳困難を抱えている。急性虚血性脳卒中の領域では、例えば、動物モデルにおいて非常に有望であった多くの薬剤は、臨床^38,39に失敗しました。これらの不本意な結果の理由は多様であり、人間のストロークシナリオおよび動物実験²¹から得られた結果の過大評価に前臨床試験システムの不倫が含まれています。臨床段階に前臨床調査結果?…

Materials

Attachment Factor	Cell-Systems Corporation	4Z0-210
Brain microvascular endothelial cells (BECs), primary, human	Cell-Systems Corporation	ACBRI 376
Complete medium	Cell-Systems Corporation	4Z0-500	Supplemented with CSC JetFuel
Complete serum-free medium	Cell-Systems Corporation	SF-4Z0-500	Supplemented with CSC RocketFue
DMEM/F-12 with 15 mM HEPES	Life Technologies	11330-032
Endothelial cells growth supplement (from bovine origin)	Sigma-Aldrich	E2759-15MG
External silicone tubing	Watson-Marlow	913.A080.016	Pumpsil brand, 8 mm internal diameter, 1.6 mm wall
Foetal calf serum	Lonza	14-501F
Gentamycin sulfate	Life Technologies	15750-060
Heparin sodium	Pfizer		1,000 U/ml
Hexamethyldisilazane (HMDS)	Sigma-Aldrich	H4875
Human brain microvascular endothelial cells	Cell-Systems Corporation	ACBRI 376
Internal silicone tubing	Watson-Marlow	913.A032.016	Pumpsil brand, 3.2 mm internal diameter, 1.6 mm wall
L-Glutamine	Life Technologies	25030
Mayer’s hematoxylin solution	Amber Scientific	MH
Minimum essential medium with Earle’s balanced salt solution	HyClone Laboratories	SH30244.01
Penicillin/Streptomycin	Life Technologies	15140
Rat collagen I	Trevigen	3440-100-01	Cultrex brand
Tissue culture inserts	Corning Life Sciences	3472	Transwell brand, 6.5 mm in diameter, with polyester porous membrane, 3 µm pore-size