שיפר שיטה להכנה מבוססת תאים, דגם מגע אנושי של מחסום דם המוח

Summary

הקמת מודלים האנושיים של מחסום דם המוח (BBB) ​​יכולה להועיל למחקר לתנאי מוח הקשורים לכישלון BBB. אנו מתארים כאן טכניקה משופרת להכנת מודל BBB מגע, המאפשר coculturing של האסטרוציטים אנושיים ותאי האנדותל במוח בצדדים המנוגדים של קרום נקבובי.

Abstract

מחסום דם המוח (BBB) ​​כולל נימים במוח בלתי חדירים, אבל להתאמה אשר בחוזקה לשלוט בסביבת המוח. כישלון של BBB כבר רמז באטיולוגיה של מחלות רבות במוח, יוצר צורך בפיתוח של אדם במודלי BBB חוץ גופית על מנת לסייע במחקר קליני רלוונטי. בין דגמי BBB הרבים עד כה תיארו, סטטי (ללא זרימה), פנה למודל BBB, שם האסטרוציטים ותאי האנדותל במוח (BECs) הם cocultured בצדדים המנוגדים של קרום נקבובי, התפתחה מערכת עדיין אותנטית פשוטה כדי לדמות את BBB עם קיבולת הקרנת תפוקה גבוהה. אף על פי כן הדור של מודל כזה מציב אתגרים טכניים כמה. כאן אנו מתארים פרוטוקול להכנת מודל BBB אדם קשר ניצול שילוב רומן של BECs האנושית הראשונית והאסטרוציטים אנושיים הונצחו. באופן ספציפי, אנחנו פירוט שיטה חדשנית לתא זריעה על מוסיף הפוך, כמו גם לציין inserטכניקות צביעת t ומדגימים כיצד אנו משתמשים במודל שלנו למחקר הקשורים ל-BBB.

Introduction

BBB הוא ממשק מיוחד בין מערכת העצבים המרכזית, מכריע אחראית לתחזוקה של עצירת דימום במוח זרימת הדם ההיקפית ו. היא כוללת תאים שונים במוח כלי הדם אנדותל (BECs) שמושפעים מבחינה תפקודית על ידי כמה מרכיבים תאיים וacellular (להלן) כדי ליצור שער חזק ודינמי אל המוח. בתנאים פיסיולוגיים BBB מגביל את המעבר של תאי דם, מרכיבי פלזמה וחומרים מזיקים, כל הפוטנציאל רעיל למערכת עצבים, למוח. במקביל, BBB סלקטיבי מחליף יוני מפתח וחומרים מזינים (גלוקוז וחומצות אמינו) ומוצרי פסולת המטבולית בין המוח ואת זרימת הדם כדי לשמור על סביבת מוח ^1,2 בדיוק. בשנים האחרונות זה הופך להיות ברור כי כישלון של BBB מתרחש במגוון רחב של פתולוגיות מוח כרוניות, כגון מחלות ניווניות או הקשורים לדלקת (למשל מחלת אלצהיימר וmultiplדואר הטרשת נפוץ, בהתאמה) ^3, כמו גם במצבים חריפים כמו שבץ איסכמי ^4.

מאפייני BBB הייחודיים של תאי האנדותל במוח (BECs) מושרים בעיקר על ידי סביבת מוחותיהם ^5, ובפרט על ידי האסטרוציטים ^6,7. יש הבנה גוברת כי תאים מסוגים אחרים, כגון pericytes ^8, תאי עצב ומיקרוגליה ^1,3, כמו גם את הקרום במרתף ^9, לתמוך BECs ויוצרים יחד יחידה תפקודית מכונה "יחידת העצבים וכלי הדם" (NVU) אשר בו זמנית זוגות עצביים דרישות חילוף חומרים לנימי אספקתם ^10.

מעורבותם של BBB במצבים פתולוגיים בבסיס ניסיונות רבים לפתח מודלים BBB חוץ גופית על מנת לסייע במחקר הקשורים ל-BBB ^11,12. מודלים אלה שואפים לחקות קרובים ככל האפשר במאפייני BBB vivo על פי עיקרון NVU. במבחנה </em> דגמי BBB בדרך כלל מסתמכים על monolayer של BECs קפוצת יוצרי צומת (בעיקר משור ^13, אדם ^14, עכברוש ^15, עכבר ^{16, ו17,18} מקורות חזיריים), יחד תרבית על קרום נקבובי עם האסטרוציטים תמיכה (בהרחבה נסקר על ידי מעדניית et al. ¹¹ 2005).

ניתן לגדל האסטרוציטים בתנאים ללא מגע ובחלק התחתון של תרבית רקמה, מופרד מBECs (טיפחה על פני השטח העליונים של הקרום) על ידי התרבות בינונית עדיין מתקשר עם BECs באמצעות גורמים מסיסים ^16. בדגמים מתקדמים יותר שטוב יותר דומה למבנה האנטומי של BBB in vivo, האסטרוציטים נשמרים בתנאי התקשרות ותרבותיים ישירות בצד השני של הקרום בסמיכות לBECs ^13,15,17 (איור 1). תצורה זו מאפשרת מגע פיזי בין BECs והאסטרוציטים, שהוקם כאשר פרויקט האסטרוציטיםהתהליכים שלהם דרך הקרום הנקבובי. חשוב מכך, למגע אמיתי להתרחש צריך להיות ≥ הנקבוביות 1μm בקוטר, שכן קצה רגליים astrocytic לא יכולות לעבור בגדלים קטנים יותר נקבוביות (כלומר 0.4 מיקרומטר) ^14,15. יש לציין, מערכות BBB קשר הם הפגינו בחלק מהמחקרים להיות עדיף על עמיתיהם שאינם אנשי הקשר שלהם בנוגע להתנגדות שלהם טרנס אנדותל החשמלי (Teer) וערכי חדירות האנדותל של קליעים נותבים שונים ^13,17,18. ממד נוסף של זרימת מדיה נוספה לאחרונה במספר במבחנה המודלים BBB ליישם כוחות גזירה לאנדותל לסימולציה קרובה יותר של כלי הדם במוח ^12,19.

מכשול טכני אחת להתגבר בעת יצירת מודל BBB קשר הוא הזריעה של האסטרוציטים כנגד כוח הכבידה על פני השטח abluminal של הקרום הנקבובי. פרוטוקולים קודמים ^13,20, שם האסטרוציטים היו פשוט זורעים בירידה של תקשורת על גבי בהוספת verted, אפשר פעמים זריעה קצרה בלבד (כלומר 10 דקות ¹³ או 2 שעות ²⁰⁾ שנמצאו בידיים שלנו לא הספיק לקובץ מצורף תא תקין. שימוש בשיטה בסיסית זו, תקופת התקשרות astrocyte כבר לא דורשת ניטור מתמיד של מוסיף על ידי פתיחה תכופה של החממה (גורמת לתנודות בטמפרטורה, חומציות ולחות), והוא גם נוטה לזריעת תא אחידה עקב דליפה של תקשורת הדרך הנקבוביות, במיוחד אם הנקבוביות גדולות יותר מאשר 1 מיקרומטר הם מועסקים.

כאן אנו מתארים פרוטוקול כללי להכנת מודל BBB ליצירת קשר. ההליך שלנו כולל את שיטה חלופית לתא זריעה על מוסיף הפוך, העוסק במגבלות שהוזכרו לעיל. השיטה מאפשרת לדבקות באין מפריע של האסטרוציטים על פני השטח קרום abluminal, בחממת equilibrated, במשך תקופה ארוכה של זמן. כתוצאה מכך, זריעה אחידה של האסטרוציטים מושגת אשר מגדילה את איכות מחסוםוממזער וריאציות חדירות בסיסי בין מוסיף.

ככל שהשימוש בתאים אנושיים הוא חשוב למחקר אנושי רלוונטי ^21, אנחנו בנוסף להפגין במאמר זה ניצול המסוים של שילוב רומן של BECs האנושית הראשונית והנציחו את האסטרוציטים אדם להקמת מודל BBB אדם מגע עם יכולת הקרנת תפוקה גבוהה . מאז שצפו בתאים בממברנות נקבוביות יכול להיות לנו גם טכניקות קשות, פרט מכתים אשר יכול לסייע בקביעת המפגש והמורפולוגיה של תאים על הקרומים נקבוביים. לבסוף, אנו מדגימים כיצד מודל BBB האנושי שלנו יכול להיות מנוצל כדי לבחון את ההשפעה של activator plasminogen רקמות מהסוג (t-PA) – אנזים קריש קורע המשמש כאפשרות טיפול יחידה לשבץ איסכמי חריף – על BBB.

Protocol

1. תרבית תאים (3-7 ימים לפני אסיפת BBB) 1.1. תאי המוח אנושי כלי הדם האנדותל ראשיים (BECs) BECs התקבלו באופן מסחרי. התאים יוצרו על ידי ניתוק dispase של רקמת קליפת המוח האנושי נורמלית ובתנאי קפוא במעבר 3 (<12 הכפלו…

Representative Results

כדי להקים אנושי, מודל BBB קשר שהיו לנו לטפח SVGs וBECs על ממברנות נקבוביות עם נקבובית בגודל 3 מיקרומטר, המוצג על מנת לאפשר מעבר של קצה רגליים astrocyte למגע עם תאי האנדותל 14,15,27,28. ייצוג סכמטי של המודל ליצירת קשר המלא מתואר באיור 1 (משמאל איור). האתגר הטכני העיקרי שהו…

Discussion

מחקר רפואי לפתולוגיות מוח סובל קושי רב translational. באזור של שבץ איסכמי חריף, למשל, תרופות רבות אשר הראו הבטחה גדולה במודלים של בעלי חיים נכשלו במרפאת ^38,39. הסיבות לתוצאות מאכזבות אלה הן מגוונות וכוללות בגידה של מערכות בדיקה קליני לתרחיש שבץ אדם וההגזמה של תוצאות שהת?…

Materials

Attachment Factor	Cell-Systems Corporation	4Z0-210
Brain microvascular endothelial cells (BECs), primary, human	Cell-Systems Corporation	ACBRI 376
Complete medium	Cell-Systems Corporation	4Z0-500	Supplemented with CSC JetFuel
Complete serum-free medium	Cell-Systems Corporation	SF-4Z0-500	Supplemented with CSC RocketFue
DMEM/F-12 with 15 mM HEPES	Life Technologies	11330-032
Endothelial cells growth supplement (from bovine origin)	Sigma-Aldrich	E2759-15MG
External silicone tubing	Watson-Marlow	913.A080.016	Pumpsil brand, 8 mm internal diameter, 1.6 mm wall
Foetal calf serum	Lonza	14-501F
Gentamycin sulfate	Life Technologies	15750-060
Heparin sodium	Pfizer		1,000 U/ml
Hexamethyldisilazane (HMDS)	Sigma-Aldrich	H4875
Human brain microvascular endothelial cells	Cell-Systems Corporation	ACBRI 376
Internal silicone tubing	Watson-Marlow	913.A032.016	Pumpsil brand, 3.2 mm internal diameter, 1.6 mm wall
L-Glutamine	Life Technologies	25030
Mayer’s hematoxylin solution	Amber Scientific	MH
Minimum essential medium with Earle’s balanced salt solution	HyClone Laboratories	SH30244.01
Penicillin/Streptomycin	Life Technologies	15140
Rat collagen I	Trevigen	3440-100-01	Cultrex brand
Tissue culture inserts	Corning Life Sciences	3472	Transwell brand, 6.5 mm in diameter, with polyester porous membrane, 3 µm pore-size