विधि रक्त मस्तिष्क बाधा के एक मानव कोशिका आधारित, संपर्क माडल की तैयारी के लिए बेहतर
Summary
रक्त मस्तिष्क बाधा (BBB) के मानव मॉडल की स्थापना बीबीबी की विफलता के साथ जुड़े मस्तिष्क की स्थिति में अनुसंधान लाभ उठा सकते हैं. हम यहाँ एक झरझरा झिल्ली के विपरीत दिशा में मानव astrocytes और मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं की coculturing परमिट जो एक संपर्क बीबीबी मॉडल, की तैयारी के लिए एक बेहतर तकनीक का वर्णन.
Abstract
रक्त मस्तिष्क बाधा (BBB) कसकर मस्तिष्क पर्यावरण नियंत्रण जो अभेद्य लेकिन अनुकूलनीय मस्तिष्क केशिकाओं शामिल हैं. बीबीबी की विफलता नैदानिक प्रासंगिक अनुसंधान में सहायता करने के लिए इन विट्रो बीबीबी मॉडल में मानव के विकास के लिए एक बनाने की जरूरत है, कई मस्तिष्क विकृतियों के एटियलजि में निहित किया गया है. इस प्रकार अब तक वर्णित अनेक बीबीबी मॉडल के अलावा, (प्रवाह) के बिना एक स्थिर, astrocytes और मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं (BECs) एक झरझरा झिल्ली के विपरीत दिशा में cocultured रहे हैं जहां बीबीबी मॉडल, संपर्क, अनुकरण के लिए एक सरल अभी तक प्रामाणिक प्रणाली के रूप में उभरा उच्च throughput प्रदर्शन क्षमता के साथ बीबीबी. फिर भी इस तरह के मॉडल की पीढ़ी कुछ तकनीकी चुनौतियां प्रस्तुत करता. यहाँ, हम प्राथमिक मानव BECs और अमर मानव astrocytes के एक उपन्यास संयोजन का उपयोग एक संपर्क मानव बीबीबी मॉडल तैयार करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन. विशेष रूप से, हम विस्तार उल्टे सम्मिलित करता है पर सेल बोने के लिए एक अभिनव पद्धति के साथ ही INSER निर्दिष्टटी धुंधला तकनीक और हम बीबीबी से संबंधित अनुसंधान के लिए हमारे मॉडल का उपयोग कैसे उदाहरण देना.
Introduction
बीबीबी परिधीय रक्त परिसंचरण और मस्तिष्क रक्तस्तम्भन के रखरखाव के लिए महत्वपूर्ण जिम्मेदार केंद्रीय तंत्रिका तंत्र, के बीच एक विशेष इंटरफेस है. यह कार्यात्मक मस्तिष्क में एक तंग और गतिशील प्रवेश द्वार के लिए फार्म (नीचे) कुछ सेलुलर और अकोशिकीय घटकों से प्रभावित हैं जो अलग मस्तिष्क microvascular endothelial कोशिकाओं (BECs) शामिल हैं. शारीरिक शर्तों के तहत बीबीबी मस्तिष्क में, रक्त कोशिकाओं, प्लाज्मा उपकरणों और हानिकारक पदार्थ, सभी संभावित न्यूरोटौक्सिक के पारित होने पर प्रतिबंध है. समानांतर में, बीबीबी चुनिंदा ठीक मस्तिष्क वातावरण 1,2 बनाए रखने के लिए मस्तिष्क और रक्त परिसंचरण के बीच मुख्य आयनों और पोषक तत्वों (ग्लूकोज और एमिनो एसिड) और चयापचय अपशिष्ट उत्पादों एक्सचेंजों. हाल के वर्षों में यह बीबीबी की विफलता ऐसे neurodegenerative या सूजन से जुड़ी बीमारियों (जैसे अल्जाइमर रोग और multipl के रूप में पुरानी मस्तिष्क विकृतियों की एक किस्म में पाया जाता है कि स्पष्ट होता जा रहा हैई इस्कीमिक स्ट्रोक 4 की तरह गंभीर स्थिति में है और साथ ही,) क्रमश: 3 काठिन्य.
मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं (BECs) की अनूठी बीबीबी गुण बड़े पैमाने पर उनके मस्तिष्क के माहौल 5 से प्रेरित है, और विशेष रूप से astrocytes 6,7 से कर रहे हैं. अन्य ऐसी pericytes 8, न्यूरॉन्स और microglia 1,3 के रूप में सेल प्रकार,, साथ ही तहखाने झिल्ली 9, BECs समर्थन और एक कार्यात्मक इकाई "neurovascular यूनिट" (NVU) करार दिया साथ कि फार्म एक बढ़ती समझ नहीं है जो एक साथ जोड़ों उनकी आपूर्ति के केशिकाओं 10 के चयापचय की मांग neuronal.
रोग स्थितियों में बीबीबी की भागीदारी बीबीबी से संबंधित अनुसंधान 11,12 में सहायता करने के लिए इन विट्रो बीबीबी मॉडल में विकसित करने के लिए कई प्रयास underlies. इन मॉडलों NVU सिद्धांत के अनुसार विवो बीबीबी विशेषताओं में संभव के रूप में बंद की नकल करना है. इन विट्रो </उन्हें> बीबीबी मॉडल आम तौर पर (एक (मुख्य रूप से गोजातीय 13 से, मानव 14, चूहे 15, माउस 16, और सुअर 17,18 मूल) तंग जंक्शन के गठन BECs के monolayer पर एक झरझरा झिल्ली पर सुसंस्कृत एक साथ समर्थन astrocytes के साथ भरोसा बड़े पैमाने पर ) डेली एट अल. 2005 11 से समीक्षा की.
Astrocytes संस्कृति के माध्यम से अभी तक घुलनशील कारकों 16 के माध्यम से BECs के साथ संवाद स्थापित करने से (झिल्ली की ऊपरी सतह पर खेती) BECs से अलग अच्छी तरह से एक टिशू कल्चर के नीचे, पर गैर संपर्क परिस्थितियों में उगाया जा सकता है. बेहतर विवो में बीबीबी की शारीरिक संरचना के समान है, जो और अधिक उन्नत मॉडल में, astrocytes संपर्क शर्तों और सीधे BECs 13,15,17 के करीब निकटता (चित्रा 1) में झिल्ली के विपरीत दिशा में सुसंस्कृत में रखा जाता है. यह विन्यास की स्थापना की, BECs और astrocytes के बीच शारीरिक संपर्क में सक्षम बनाता है जब astrocytes परियोजनाझरझरा झिल्ली के माध्यम से उनकी प्रक्रियाओं. Astrocytic अंत फुट छोटे रोमकूप आकार (यानी 0.4 माइक्रोन) 14,15 के माध्यम से पारित नहीं कर सकते क्योंकि महत्वपूर्ण बात है, के लिए होते हैं एक सच संपर्क के लिए pores, व्यास में 1μm ≥ किया जाना चाहिए. विशेष रूप से, संपर्क बीबीबी प्रणालियों उनके पार endothelial विद्युत प्रतिरोध (तीर) और विभिन्न tracers 13,17,18 के endothelial पारगम्यता मूल्यों के बारे में उनकी गैर संपर्क समकक्षों से बेहतर कुछ अध्ययनों में प्रदर्शन कर रहे हैं. मीडिया के प्रवाह के लिए एक अतिरिक्त आयाम हाल ही में मस्तिष्क vasculature 12,19 के करीब अनुकरण के लिए अन्तःचूचुक को कतरनी बलों को लागू करने के लिए इन विट्रो बीबीबी मॉडल की एक संख्या में जोड़ा गया है.
एक संपर्क बीबीबी मॉडल पैदा जब काबू पाने के लिए एक तकनीकी बाधा झरझरा झिल्ली के abluminal सतह पर गुरुत्वाकर्षण के खिलाफ astrocytes के बोने है. Astrocytes बस एक में से शीर्ष पर मीडिया की एक बूंद में वरीयता प्राप्त थे जहाँ पिछले प्रोटोकॉल 13,20,verted डालने की अनुमति, केवल कम बोने बार उचित सेल लगाव के लिए अपर्याप्त होने के लिए हमारे हाथ में पाए गए जो (यानी 10 मिनट 13 या 2 घंटा 20). इस बुनियादी विधि का प्रयोग, एक लंबे समय तक astrocyte लगाव अवधि (तापमान, पीएच और नमी में उतार चढ़ाव के कारण) इनक्यूबेटर के लगातार उद्घाटन द्वारा आवेषण की लगातार निगरानी की आवश्यकता है और, कारण छिद्रों के माध्यम से मीडिया के रिसाव को भी असमान सेल बोने की संभावना है, खासकर 1 माइक्रोन से बड़ा pores कार्यरत रहे हैं.
यहाँ, हम एक संपर्क बीबीबी मॉडल तैयार करने के लिए एक सामान्य प्रोटोकॉल का वर्णन. हमारी प्रक्रिया से ऊपर उल्लेख किया सीमाओं जो पते उल्टे सम्मिलित करता है, पर सेल बोने के लिए एक वैकल्पिक तरीका भी शामिल है. विधि समय की एक विस्तारित अवधि के लिए, एक equilibrated इनक्यूबेटर में, abluminal झिल्ली सतह पर astrocytes की अबाधित पालन परमिट. नतीजतन, astrocytes के एक समान बोने बाधा गुणवत्ता बढ़ जाती है जो हासिल की हैऔर आवेषण के बीच बेसल पारगम्यता विविधताओं को कम करता है.
मानव कोशिकाओं का उपयोग मानव प्रासंगिक अनुसंधान 21 के लिए महत्वपूर्ण है, हम इसके अतिरिक्त इस लेख में प्राथमिक मानव BECs के एक उपन्यास संयोजन की विशिष्ट उपयोग का प्रदर्शन और एक उच्च throughput प्रदर्शन क्षमता के साथ एक संपर्क मानव बीबीबी मॉडल की स्थापना के लिए मानव astrocytes अमर . झरझरा झिल्ली पर कोशिकाओं के देखने झरझरा झिल्ली पर संगम और सेल आकारिकी के निर्धारण में सहायता कर सकते हैं, जो मुश्किल है, हम भी विस्तार धुंधला तकनीक हो सकता है. बीबीबी पर – तीव्र इस्कीमिक स्ट्रोक के लिए एकमात्र इलाज के विकल्प के रूप में कार्य करता है जो एक थक्का को ख़त्म एंजाइम – अंत में, हम अपने मानव बीबीबी मॉडल ऊतक प्रकार plasminogen उत्प्रेरक का प्रभाव (टी पीए) की जांच करने के लिए उपयोग किया जा सकता है कि कैसे उदाहरण देना.
Protocol
Representative Results
Discussion
मस्तिष्क विकृतियों में चिकित्सा अनुसंधान बहुत translational कठिनाई ग्रस्त है. तीव्र इस्कीमिक स्ट्रोक के क्षेत्र में, उदाहरण के लिए, पशु मॉडल में महान वादा दिखाया जो कई दवाओं क्लिनिक 38,39 पर विफल रही है. इन नि?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अध्ययन ऑस्ट्रेलिया की राष्ट्रीय स्वास्थ्य और चिकित्सा अनुसंधान परिषद (अनुदान # 606,658) से RLM के लिए सम्मानित किया अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया.
Materials
| Attachment Factor | Cell-Systems Corporation | 4Z0-210 | |
| Brain microvascular endothelial cells (BECs), primary, human | Cell-Systems Corporation | ACBRI 376 | |
| Complete medium | Cell-Systems Corporation | 4Z0-500 | Supplemented with CSC JetFuel |
| Complete serum-free medium | Cell-Systems Corporation | SF-4Z0-500 | Supplemented with CSC RocketFue |
| DMEM/F-12 with 15 mM HEPES | Life Technologies | 11330-032 | |
| Endothelial cells growth supplement (from bovine origin) | Sigma-Aldrich | E2759-15MG | |
| External silicone tubing | Watson-Marlow | 913.A080.016 | Pumpsil brand, 8 mm internal diameter, 1.6 mm wall |
| Foetal calf serum | Lonza | 14-501F | |
| Gentamycin sulfate | Life Technologies | 15750-060 | |
| Heparin sodium | Pfizer | 1,000 U/ml | |
| Hexamethyldisilazane (HMDS) | Sigma-Aldrich | H4875 | |
| Human brain microvascular endothelial cells | Cell-Systems Corporation | ACBRI 376 | |
| Internal silicone tubing | Watson-Marlow | 913.A032.016 | Pumpsil brand, 3.2 mm internal diameter, 1.6 mm wall |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030 | |
| Mayer’s hematoxylin solution | Amber Scientific | MH | |
| Minimum essential medium with Earle’s balanced salt solution | HyClone Laboratories | SH30244.01 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140 | |
| Rat collagen I | Trevigen | 3440-100-01 | Cultrex brand |
| Tissue culture inserts | Corning Life Sciences | 3472 | Transwell brand, 6.5 mm in diameter, with polyester porous membrane, 3 µm pore-size |
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