Улучшенная способ получения человеческой клетки на основе, Связаться Модель гематоэнцефалического барьера

Summary

Создание человека моделей гематоэнцефалический барьер (BBB) ​​может принести пользу исследования в условиях мозга, связанных с отказом BBB. Опишем здесь улучшенную методику для подготовки модели BBB контакта, что позволяет сокультивировани человеческих астроцитов и эндотелиальных клетках головного мозга на противоположных сторонах пористой мембраны.

Abstract

Гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) включает непроницаемые но адаптируемые капилляры мозга, которые плотно контролируют окружающую среду мозга. Выход из строя BBB была подразумеваемых в этиологии многих патологий головного мозга, создавая потребность в развитии человека в пробирке моделей BBB для оказания помощи в клинически соответствующих исследований. Среди многочисленных моделей BBB до сих пор описанных, статический (без потока), обратитесь ВВВ модель, в которой астроциты и эндотелиальных клетках головного мозга (БЭК) будут совместно культивировали на противоположных сторонах пористой мембраны, возникла как упрощенной еще аутентичной системы для моделирования BBB с высокопроизводительного скрининга мощности. Тем не менее, поколение этой модели представляет несколько технических проблем. Здесь мы опишем протокол для приготовления контакт человека BBB модели с использованием новой комбинацией первичных человеческих БЭК и увековечены человека астроцитов. В частности, мы подробно инновационный метод посева клеток на перевернутых вставками, а также указать INSERт методы окраски и примером того, как мы используем нашу модель для BBB-исследований, связанных с.

Introduction

BBB является специализированным интерфейсом между периферического кровообращения и центральной нервной системы, что особенно важно, ответственного за поддержание мозга гемостаза. Она включает в себя различные мозговые микрососудистых эндотелиальных клетках (БЭК), которые функционально зависит от нескольких клеточных и бесклеточных компонентов (ниже) с образованием жесткой и динамический шлюз в мозг. В физиологических условиях BBB ограничивает прохождение клеток крови, плазмы и компонентов вредных веществ, все потенциально нейротоксические, в мозг. Параллельно с этим BBB выборочно обменивается ключевые ионы и питательные вещества (глюкоза и аминокислоты) и продуктов обмена веществ между мозгом и циркуляции точно поддерживать среду мозга ^1,2. В последние годы становится очевидным, что выход из строя BBB происходит в различных хронических патологий головного мозга, таких как нейродегенеративные или воспалительных заболеваний (например, болезни Альцгеймера и Multiplе склероз, соответственно) ^3, а также в острых заболеваний, как ишемический инсульт ^4.

Уникальные свойства BBB эндотелиальных клетках головного мозга (БЭК) в значительной степени индуцируется их головного среды ^5, и, в частности, астроциты ^6,7. Существует понимание того, что другие сотовые типы, такие как перицитами ^8, нейронов и микроглии ^1,3, а также базальная мембрана ^9, поддерживает БЭК и образуют вместе функциональный блок называется "нервно-сосудистого аппарата" (NVU), который одновременно пары нейронных метаболические требования к их поставщикам капилляров ^10.

Участие BBB в патологических ситуациях лежит в основе многочисленных попытки развить в пробирке моделей BBB для оказания помощи в BBB-исследований, связанных с ^11,12. Эти модели направлены, чтобы имитировать как можно ближе в естественных условиях BBB характеристик в соответствии с принципом НВУ. Экстракорпоральное </EM> модели BBB обычно полагаются на монослой плотно распределительных формирования БЭК (в основном из шкур крупного рогатого скота ¹³ человека ^14, крысы ^15, мыши ¹⁶ и свиных ^17,18 происхождения), культивировали на пористую мембрану вместе со вспомогательными астроцитов (широко рассмотрены Deli и др.. 2005 ^11).

Астроциты могут быть выращены в бесконтактных условий в нижней части культуре ткани также, отделенной от БЭК (культивируемых на верхней поверхности мембраны) по культуральную среду еще общении с БЭК с помощью растворимых факторов ^16. В более продвинутых моделей, которые лучше напоминают анатомическое строение ГЭБ в естественных условиях, астроциты ведутся в условиях контакта и культивируют непосредственно на противоположной стороне мембраны в непосредственной близости от БЭК ^13,15,17 (рис. 1). Такая конфигурация позволяет физический контакт между БЭК и астроцитов, устанавливается, когда астроциты проектих процессы через пористую мембрану. Важно отметить, что для настоящего контакта, чтобы произойти поры должны быть ≥ 1 мкм в диаметре, так как астроцитарных конечные ноги не могут пройти через меньших размеров пор (т.е. 0,4 мкм) ^14,15. Примечательно, что контакт BBB системы демонстрируются в некоторых исследованиях, превосходит их бесконтактных коллегами в отношении их транс-эндотелиальной электрического сопротивления (Тир) и эндотелиальных значений проницаемости различных индикаторов ^13,17,18. Дополнительный аспект медиапотока недавно был добавлен в ряде моделей в пробирке BBB применить усилия сдвига к эндотелию к более тесному моделирования сосудистой мозговой ^12,19.

Одним из технических препятствие преодолеть при создании модели контакт ВВВ является посев астроцитов против силы тяжести на abluminal поверхности пористой мембраны. Предыдущие протоколы ^13,20, где астроциты были просто посеянные в капле СМИ на вершине инпреобразуется вставка, разрешается раз только короткая посева (т.е. 10 мин ¹³ или 2 часа ^20), которые были найдены в наших руках, чтобы быть недостаточно для надлежащего прикрепления клеток. Используя этот базовый метод, период больше привязанность астроцитов требуется постоянный мониторинг вставок по частого открывания инкубатора (причинение колебания температуры, рН и влажности), а также склонны к неравномерному посева клеток вследствие утечки СМИ через поры, особенно если используются поры, размер которых превышает 1 мкм.

Здесь мы описываем общий протокол для подготовки модели контакт BBB. Наша процедура включает альтернативный способ посева клеток на перевернутых вставками, в которой рассматриваются вышеупомянутые ограничения. Способ позволяет спокойно прилипание астроцитов на abluminal поверхности мембраны, в равновесном инкубаторе в течение длительного периода времени. В результате равномерный посев астроцитов достигается который повышает качество барьернойи минимизирует базальные изменения проницаемости между вставками.

Поскольку использование человеческих клеток имеет важное значение для исследования человеческой релевантных ^21, мы дополнительно продемонстрировать в этой статье с ростом удельной загрузки новой комбинации первичных человеческих БЭК и увековечил человека астроциты для создания контакта человека BBB модели с высокопроизводительного скрининга мощности . С просмотра клеток на пористых мембран может быть трудно, мы также методы окраски детали, которые могут помочь в определении слияния и морфологии клеток на пористых мембран. Наконец, мы примером того, как наша человеческая модель BBB могут быть использованы для изучения влияния тканевого типа активатора плазминогена (ТАП) – сгусток перебора фермент, который служит в качестве единственного варианта лечения острого ишемического инсульта – на BBB.

Protocol

1. Культура клеток (3-7 дней до BBB Ассамблеи) 1.1. Первичные элементы Человеческий мозг Микрососудистой эндотелия (БЭК) БЭК были коммерчески получены. Клетки были произведены диспаза диссоциации нормальной человеческой коры головного мозга ткани и при условии, …

Representative Results

Для того чтобы установить человека, контакт ВВВ модель мы должны были культивировать SVGs и БЭК на пористых мембран с размером пор 3 мкм, как показано, чтобы разрешить прохождение астроцитов конечных ног для контакта с эндотелиальных клеток 14,15,27,28. Схематическое представление полн?…

Discussion

Медицинские исследования в патологии мозга страдает много поступательное трудности. В области острого ишемического инсульта, например, многие препараты, которые показали большие перспективы в моделях на животных не удалось в клинике ^38,39. Причины этих разочаровывающих результа?…

Materials

Attachment Factor	Cell-Systems Corporation	4Z0-210
Brain microvascular endothelial cells (BECs), primary, human	Cell-Systems Corporation	ACBRI 376
Complete medium	Cell-Systems Corporation	4Z0-500	Supplemented with CSC JetFuel
Complete serum-free medium	Cell-Systems Corporation	SF-4Z0-500	Supplemented with CSC RocketFue
DMEM/F-12 with 15 mM HEPES	Life Technologies	11330-032
Endothelial cells growth supplement (from bovine origin)	Sigma-Aldrich	E2759-15MG
External silicone tubing	Watson-Marlow	913.A080.016	Pumpsil brand, 8 mm internal diameter, 1.6 mm wall
Foetal calf serum	Lonza	14-501F
Gentamycin sulfate	Life Technologies	15750-060
Heparin sodium	Pfizer		1,000 U/ml
Hexamethyldisilazane (HMDS)	Sigma-Aldrich	H4875
Human brain microvascular endothelial cells	Cell-Systems Corporation	ACBRI 376
Internal silicone tubing	Watson-Marlow	913.A032.016	Pumpsil brand, 3.2 mm internal diameter, 1.6 mm wall
L-Glutamine	Life Technologies	25030
Mayer’s hematoxylin solution	Amber Scientific	MH
Minimum essential medium with Earle’s balanced salt solution	HyClone Laboratories	SH30244.01
Penicillin/Streptomycin	Life Technologies	15140
Rat collagen I	Trevigen	3440-100-01	Cultrex brand
Tissue culture inserts	Corning Life Sciences	3472	Transwell brand, 6.5 mm in diameter, with polyester porous membrane, 3 µm pore-size