Summary
Hawaiensis amphipod Parhyale הוא אורגניזם מודל מבטיח ללימודים של אמבריולוגיה הסרטנים ופיתוח arthropod השוואתי ואבולוציה. פרוטוקול זה מתאר שיטה להסרה ידנית של לסטומרים אחד מעוברים בשלב המוקדמים של מחשוף Parhyale.
Abstract
Hawaiensis amphipod Parhyale הוא סרטנים קטנים שנמצאו בבתי הגידול ימיים intertidal ברחבי העולם. במהלך העשור האחרון, Parhyale התפתחה כאורגניזם מודל מבטיח למחקרי מעבדה של פיתוח, מתן השוואת קבוצת חוץ שימושית לאורגניזם מודל arthropod למד היטב תסיסנית. בניגוד לשסעים לי עובריים של תסיסנית, השסעים המוקדמים של Parhyale הם holoblastic. מיפוי גורל באמצעות צבעים נותב מוזרקים לתוך לסטומרים מוקדם הראו כי כל שלוש השכבות הנבט והקו נבט נקבעו בשלב שמונה תאים. בשלב זה, שלושה לסטומרים נגזר על להצמיח האאקטודרם, שלוש נגזרו על להצמיח המזודרם, ושני לסטומרים הנותרים הם המבשרים של הקו האנדודרם ונבט בהתאמה. עם זאת, ניסויי אבלציה blastomere הראו כי עוברי Parhyale גם להחזיק capabiliti רגולציה משמעותיתes, כזה גורלות לסטומרים ablated בשלב שמונה התא ניתן השתלטו צאצאים כמה לסטומרים הנותר. אבלציה Blastomere כבר בעבר שתוארה על ידי אחת משתי שיטות: הזרקה וההפעלה הבאה של צבעי phototoxic או אבלציה הידנית. עם זאת, photoablation הורג לסטומרים אך אינו מסיר את התאים המת מהגוף את העובר. ההסרה פיזית מלאה של לסטומרים ספציפי ולכן עשויה להיות שיטה מועדפת של אבלציה עבור יישומים מסוימים. כאן אנחנו מציגים פרוטוקול להסרה ידנית של לסטומרים אחת מבמת שמונה התאים של עוברי Parhyale, הממחיש את המכשירים ונהלים ידניים הכרחיים להסרת תאי הגוף מלאה, תוך שמירה על לסטומרים שנותר בחיים ושלמים. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על כל תא Parhyale בשלב שמונה תאים, או ללסטומרים שלבי מחשוף המוקדם אחרים. בנוסף, באופן עקרוני בפרוטוקול זה יכול להיות ישים לקליאה המוקדמתעובר שלב vage של חסרי חוליות ימיות holoblastically ביקוע אחרות.
Introduction
Hawaiensis Parhyale סרטני amphipod התפתחה בעשור האחרון כאורגניזם מודל מבטיח עם פוטנציאל גדול לשימוש במחקר בביולוגיה התפתחותית אבולוציונית 1. בין פרוקי הרגליים, רוב מערכות מודל הן חרקים, ולמדו נרחב ביותר של אלה הוא זבוב הפירות melanogaster דרוזופילה. ד melanogaster הוא חבר Diptera כדי חרקים, וכמו תכונות עובריות רבות מציג באופן שנגזרות ביחס לאלו של חרקים basally הסתעפות 2. יתר על כן, חרקים מקוננים בתוך subphylum Pancrustacea 3, כלומר יש לי חרקים קרובי המשפחה הקרובות ביותר שלהם בתוך הקבוצה ארוכת השנים "הטבעית" בשם pancrustaceans, וכי קבוצה זו היא paraphyletic. הדבר מצביע על כך, בנוסף להסתעפות basally דגמי חרקים, מחקרים של סרטנים אחרים נדרשים כדי לקבל תצוגה רחבה יותר של ההיסטוריה האבולוציונית של התכונות התפתחותיותמנגנונים מולקולריים nd שנחקרו כל כך טוב בד melanogaster. עם זאת, מעט מאוד סרטנים כבר מבוססים היטב על ניתוח מעבדה ניסיוני של פיתוח. Amphipod פ hawaiensis היא מערכת מודל מעבדה צייתנית מאוד, נוחה למגוון של טכניקות ניסוי. Amphipods להציג תכונות ייחודיות רבות בתוך superorder ההורה שלהם Peracarida (מינן חוף, סקדים, ושרימפס היטב), ולכן חשב שניתן להפיק יחסית בתוך קבוצה זו של סרטנים. עם זאת, קלות היחסית של מניפולציה גנטית עוברית ופונקציונלית המוצע על ידי Parhyale להפוך amphipod זו תוספת רבת ערך למלאי הנוכחי של אורגניזמים מודל.
כחיות מעבדה, פ hawaiensis מציע יתרונות רבים. בעלי חיים הם סובלניים למגוון רחב של טמפרטורות ומליחות, ולשרוד גם בתרבויות גדולות של מי ים מלאכותי 1. זה קל להבחין betwזכרים ונקבות een מבוססים על הבדלים מורפולוגיים ברורים, בעיקר, איברים הגדולים, מכור, תא מטען קדמי כי גברים להשתמש בו כדי לתפוס את הנקבות בעת ההזדווגות. לעבודה עוברית והתפתחותי, פ יש hawaiensis כמה תכונות מושכת מאוד. עובר נמשך כ 10 ימים והזמן לבגרות מינית הוא כשישה שבועות ב28 º C (אבל שים לב שParhyale שורד גם בטמפרטורות הנעות בין כ 20-30 º C, וכי מידע בימוי התפתחותית מפורט נגיש לעוברים הועלו ב18 º C 4 , 25 C º 4, ו26 º C 5,6). מבוגרים הזדווג בכל ימות במעבדה השנה, כך שהעוברים זמינים בכל עת של שנה. נקבות מטיל 2-20 (תלוי בגיל של נקבה) ביצים המופרות לתוך כיס דגירה הגחון ממוקם בין כמה הזוגות הראשונים של רגליים (איורים 1 א ו 1 ב '), ואפשר לאסוף עובר אלהזה מוקדם מאוד בפיתוח בלי להרוג את הנקבה או פגיעה בעוברים (איור 1 ג). העוברים לשרוד במי ים מלאכותיים מסוננים דרך לבקיעה, יכולים להיות קבועים לביטוי גנים שלאחר מכן או ניתוח היסטולוגית 7, ושולחן היערכות מפורט מאפשר זיהוי מדויק של ההתקדמות בפיתוח 5. פרוטוקולים חזקים שימשו כדי לבצע ניתוח ביטוי גנים על ידי הכלאה באתר 8-15 או immunostaining 4,16,17, מציאה פונקציונלית על ידי התערבות RNA 13,15 או 12 morpholinos, וקו נבט יציב Transgenesis 18. שימוש במערכת transgenesis, הביטוי מושרה 14 ומלכודת משפר גם 19 שיטות יכולות לשמש כדי לחקור את תפקוד גן בפ hawaiensis. בעוד רצף הגנום זמין לציבור אינו זמין כרגע, יש transcriptome מכיל תעתיקים נוצרים במהלך oogenesis ועובר דבורהn דה נובו התאסף ומבואר 20, והופקד במסד נתונים לחיפוש 21, הנחיית גילוי גן. לסיכום, פ hawaiensis הוא אורגניזם מודל צייתן מאוד מתאים לגישות ניסיוניות וגנטיות רבות להבנת התפתחות.
בניגוד לשסעים לי עובריים המוקדמים של ד melanogaster, פ עוברי hawaiensis לדבוק holoblastically הבא (איור 2 א) הפריה. ניתוח התחקות שושלת הראה כי על ידי מחשוף שלישי, כל אחד מלסטומרים המחשוף השלישי נגזר במיוחד כדי להצמיח אחד משלוש השכבות נבט או הקו נבט 6 (איור 2). נתונים אלה, יחד עם נתוני microarray 22, שושלת תא מנתח 6,23, וניסויים בידוד blastomere 4 הראו כי פוטנציאל התפתחותי מופרד ללפחות חלק לסטומרים מחשוף שלישי בירושה סימטרית של celגורמי גורל ליטר. בהתאם לכך, בניסויי אבלציה blastomere שבמבשר שורת הנבט (שמכונה "G" במינוח שושלת תא Parhyale 6) הוסר בשלב התא שמונה, עוברים חסרי תאי נבט בשלבי התפתחותיים מאוחרים יותר 4, כפי שצוינו על ידי ההעדר של תאים המבטא את החלבון ושה, אשר מהווה סמן שורה נבט ברוב metazoans 24. לעומת זאת, ניסויי אבלציה blastomere גופניים הראו כי פ עוברי hawaiensis גם בעלי יכולות רגולציה משמעותיות, כך שגורלם של מבשר לסטומרים המזודרם או האאקטודרם מלוטש בשלב שמונה תאים שניתן לנקוט על ידי צאצאיהם של חלק מלסטומרים נותר 25. איך החלפת גורל תא ויסות יכולה להתרחש, ועל ידי לסטומרים סומטיים היקף אימוץ גורל תא אוטונומי, נותר עלום. טכניקות עובריות ניסיוניות כגון אבלציה blastomere יכולות להיות שימושיות במבדינג האוטונומיה היחסית וnonautonomy של החלטות גורל תא 26,27 ולכן עניין במחקר של פ עובר hawaiensis.
בניסויים שהדגימו החלפה רגולטיביות של שושלות ectodermal וmesodermal, אבלציה blastomere בוצעה על ידי הזרקה 28 והעירור הבא של צובעת phototoxic 25. אמנם שיטה זו היא יעילה להרוג blastomere (ים) המוזרק, זה לא להסיר לחלוטין את גוף תאים המת מן העובר. בנוסף, הבדלים שנצפו בין נתונים שנאספו באמצעות שושלת תא לשלבי gastrulation של עובר על ידי הזרקת לסטומרים עם קליעים נותבים שושלת ניאון 28,29, ונתונים שנאספו על ידי ביצוע לסטומרים מוטרד באמצעות פיתוח של אותו שלבים עובריים 23. ההסרה גופנית מלאה של לסטומרים ספציפי ולכן עשויה להיות שיטה מועדפת של אבלציה עבור יישומים מסוימים.
אנחנו שפורסמו בעבר התוצאות של שושלת תא ניתוחים של עוברים שבו תאים בודדים היו ablated 23 באופן ידני. יחד עם זאת, הפעולות העדינות נדרשו להסיר לסטומרים אחד מעוברים בשלב מחשוף מוקדמים טרם תוארו באופן מלא. כאן אנו מציגים פרוטוקול לאוסף של פ עוברי hawaiensis ואבלציה הידנית של blastomere בודד מעובר בשלב שמונה תאים. מטרתה של שיטה זו היא להשיג הסרה מלאה של גוף התא מהעובר, ומאפשר התבוננות בהתנהגויות הסלולר ויכולות גורל תא של התאים שנותרו בעובר והתפתחות פוסט עוברי. הפרוטוקול שלנו מראה הסרת g שורת נבט המבשר (איור 2 ג), אבל יכול להיות מיושם על כל תא בשלב שמונה תאים, או ללסטומרים שלבי מחשוף קודם לכן. באופן עקרוני, פרוטוקול זה יכול להיות מיושם להסרת תאים בודדים מעוברי שלב מחשוף המוקדמים של other holoblastically ביקוע חסרי חוליות ימיות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
תגובות שעשויות להיות מועילים בביצוע צעדים מסוימים מסומנות בכתב נטוי.
1. יום 1: הכנה של חומרים
- הכן את החומרים הבאים (ראה טבלה של חומרים וציוד):
- 15 סנטימטר ו22 טפטפות פסטר סנטימטר
- סופר יהלומים
- מי ים מלאכותי מסונן (מליחות בין 0.0018-.0020) המכילה 1 מ"ג / מיליליטר Amphotericin B (1:100 של פתרון מניות 100 מ"ג / מיליליטר), 100 יחידות / מיליליטר פניצילין ו100 מ"ג / מיליליטר סטרפטומיצין (01:50 של פתרון מניות המכיל 5,000 / מיליליטר יחידות פניצילין ו -5,000 מ"ג / מיליליטר סטרפטומיצין)
- מים מסוננים מלאכותיים ים (מליחות בין 0.0018-0.0020) ללא תוספים
- מיכל פלסטיק גדול לזוג לדיור (לפחות 15 סנטימטר x 15 סנטימטר X 5 ס"מ)
- צלחות פטרי קטנות (3 סנטימטר או 5 ס"מ) מרופדות בSylgard
- צלחות פטרי (3 סנטימטר או 5 ס"מ) קטנות
- watchglass או זכוכית רב גם
- מלקחיים (אנו משתמשים במלקחיים בוטים נגזרים לכאן ולכאןמלקחיים מ 'ישן דומון # 5 שנפגעו בטעות בנהלי מעבדה אחרות, שיש לנו לשנות את ייעודו באמצעות מלקחיים חידוד אבן, כדי להבטיח שקצות המלקחיים חלקים, ששני שיניים הן באותו אורך, ושכבר אין להם נקודות חדות. מלקחיים עדינים ביותר, כגון דומון # 5 מלקחיים חדשים, אינם רצויים כיוון שהם עלולים לפגוע בעוברים ו / או נקבות).
- פיפטה פסטר עם הסוף התרחבה (ראה שלב 1.2 להלן)
- כלי אחזור עובר מורכב מחוט דק, מעוקל טונגסטן מוטבע לתוך הסוף הדק של פיפטה פסטר (יכולים להיות מוחלפים על ידי חלופה ליישם; לראות 1.3 להלן)
- פיפטה בפה עם פתח קטן (ראה שלב 1.4 להלן)
- מחט זכוכית עשויה מזכוכית משך נימים (ראה שלב 1.5 להלן)
- כדי להפוך את פיפטה התרחבה פסטר, ציון בסיבוב הראשון פיפטה פסטר 15 סנטימטר בנקודה שבי פיפטה תתחיל לצמצם עם סופר יהלומים, לעטוף את האזור קלע של פיפטה במגבת Kimwipe או נייר כדי להגן על האצבעות, ולאחר מכן בזהירות לשבור את הקצה בקו הציון. החזק את קצו השבור של פיפטה מעל להבת מבער בונזן במשך כמה שניות כדי להחליק את הקצוות. הפתיחה צריכה להיות מעט צרה יותר מהרוחב המרבי של טפטפת.
- על מנת להפוך את הכלי לנתח תיל טונגסטן, הכנס תיל טונגסטן לסוף הזכוכית פיפטה פסטר 15 סנטימטר, ומחזיק לזמן קצר על אש מבער בונזן כדי להמס את הזכוכית, תיקון החוט במקום. שימוש במלקחיים בעדינות לעקומת קצה החוט לצורת מכור. ראה איור 3 לדוגמה לצורה מתאימה לכלי הזה.
- כדי להפוך את פתח קטן לפיפטה בפה, למשוך את הקצה הדק של פיפטה פסטר 22 סנטימטר לשני החלקים ovאה להבה, ולשבור את הקצה של הקצה הקטן. הכנס לסוף בעל פיפטה בפה.
- הפוך את מחט הזכוכית שתשמש לנקב לסטומרים של עניין במהלך הליך אבלציה באמצעות חולץ מחט. מחט בצורה כראוי מוצגת באיור 4. מחט זו משכה על חולץ מחט p97 סאטר באמצעות תכנית עם פרמטרים 2x (חום = 566, למשוך = 100, מהירות = 20, זמן = 250) + 1X (חום = 566, למשוך = 100, מהירות = 100, זמן = 250). התכנית הספציפית והמכשיר משמש לייצור את המחט יכולים להשתנות, אבל המחט חייבת להיות נקודה עדינה, ועם זאת גם להיות יציב מספיק כדי לא לשבור כאשר דחף נגד סיסית של העובר.
2. יום 1: זוגות התכנסות Parhyale מזווגים
- השתמש פיפטה פסטר התרחבה (שלב 1.2 לעיל) כדי לאסוף הזדווגות פ זוגות hawaiensis מיכל התרבות הגדול, ולהעביר אותם למכל המכיל ג נפרדלהישען מי ים מלאכותי. אין זה הכרחי כי מי ים זה להיות מסונן. עדיף לאסוף זוגות הזדווגות בשעתי אחר הצהריים המאוחרים ולהשאיר את הזוגות בטמפרטורת חדר (20-23 מעלות צלזיוס) בלילה, כך שלמחרת בבוקר, רוב העוברים יהיו כבר מופרים לאחרונה והופקדו, ולכן במחשוף שלבים המוקדם מתאים אבלציה. לאסוף לפחות 20 זוגות הזדווגות כדי להבטיח שכמה נקבות תהיה נשיאת עוברי שלב מוקדם על ידי מחשוף למחרת בבוקר.
3. יום 2: התכנסות Parhyale עוברים
- בוקר למחרת, להחדיר מי ים מלאכותי מסונן (FASW) עם CO 2. כמה מהנשים תהיה בשחייה חופשית מהזכרים שלהם במהלך הלילה; לאסוף נשים מופרדות אלה ומרדימים אותם בFASW / CO 2. הזכרים מזווגים הנותרים ניתן להסיר מיכל זוג הזדווגות וחזרו לתרבות הגדולה. זוגות הזדווגות שנותרו ניתן לשמור לאוסף עובר מאוחר יותרביום או ביום שלמחרת.
- העבר את הנקבה מורדמת אחת נושאת עובר לזכוכית שעון בFASW / CO 2. כל הנקבות מופרדות צפויות הפקידו ביצים, שיהיה גלוי על ידי העין כורודה חיוור או סגולים הספרואידים דרך צלחות coxal השקופה של הנקבות (איור 1 א). כדי לקבוע אם הם עובר בשלבי מחשוף מוקדמים ובכך מתאים לאבלציה blastomere, החוקר צריך להסיר את העוברים מהכיס להרהר ולבחון אותם תחת מיקרוסקופ.
- צופה בהליך תחת מיקרוסקופ לנתח, לתפוס את צלחות coxal לאורך צד אחד של הגוף עם מלקחיים. עוברים יהיו גלויים בכיס הדגירה הגחון בין צלחות coxal אלה (איור 1).
- להכניס את הכלי הדק, מעוקל תיל (איור 3; צעד 1.3 לעיל) אל הקצה האחורי של כיס הדגירה, ועדינות להרים את החוט לקראת הסוף הקדמי של הנרתיק להרהר להפריד הגוזליםכיסויי נרתיק (אלה הותאמו נספחים הגחון נקראים oostegites 30), שפתח את הכיס והתרופפות העוברים. עוברים שנמצאים בשעה הראשונה של שהניח כולם סגורים בתוך קרום דק מאוד ושקוף שיהיה בקלות להיות מופר על ידי כלי התיל; קרום זה נעלם על ידי כ 2-3 שעות לאחר הטלת ביצים, ועוברים אינם מאוגדים לזה או לנקבה בכל דרך מנקודה זו ואילך בכל עובר. אם חוקרים מוצאים את זה לא נוח או קשה לתמרן את כלי התיל המעוקל להסיר את העוברים מכיס הדגירה, אלטרנטיבי ליישם עשוי לשמש, כל עוד התנועות עדינות ולא בלחץ קשה מוחל על העוברים או את כיס הדגירה. כלים אחרים מתאימים להסרת עוברים מכיס הדגירה כוללים מלקחיים קהות או נימי זכוכית עם קצה אטום ומוחלק.
- השתמש פיפטה 15 פסטר סנטימטר ללא שינוי כדי לשטוף מים דרך כיס הדגירה נפתח, דוחף החוצה tהוא עובר, שאמור ליישב לתחתית של זכוכית השעון. העבר את הנקבה כדי לנקות FASW (ללא CO 2), כדי לאפשר התאוששות לפני reintroducing לתרבות המרכזית. ניתן להציב נקבות מרובות לתוך את אותה המנה התאוששות, אלא לאפשר נקבות כדי להחלים לחלוטין לפני שמחזירים אותם לתרבות הראשית, כיוון שהם עלולים להיאכל על ידי בעלי חיים אחרים אם הם עדיין מורדמים באופן חלקי.
- השתמש פיפטה 15 פסטר סנטימטר ללא שינוי להעביר את העוברים לצלחת פטרי עם FASW הנקי, ולהציג תחת מיקרוסקופ כדי לקבוע בשלב העוברי שלהם. עוברים נפרדים שנמצאים במחשוף השלישי (שלב 4 5), אשר מתאים להליך זה. זה צריך להיות אפשרי גם להחלת פרוטוקול זה לכל שלב מחשוף לפני היווצרות דיסק נבט (שלבי 7-8 מאי).
4. תאים בודדים ablating: יום 2
- מלא צלחת פטרי מרופדת Sylgard בשכבה רדודה של FASW. השתמש pi פסטר 15 סנטימטר ללא שינויpette להעביר עובר אחת לצלחת.
- בעזרת מלקחיים בוטים, בעדינות מגלגל את העובר כדי לזהות את התא להיות ablated (2A דמויות ו2B). גרם מבשר שורת הנבט יכול להיות מזוהה כmicromere הקטן ביותר, היושב על גבי Mav macromere הקטן ביותר. בנוסף, גרם לא ישירות לפנות לתא צמוד, המהווה את micromere ישירות מולו, כמיליליטר micromeres מבשר המזודרם ונתח mr גבול תא באמצע של העובר. Mr הוא blastomere מימין גרם, ו מיליליטר הוא micromere משמאל גרם. Macromeres אחותו של מר, מיליליטר, וחדר הם מבשרי האאקטודרם אה, אל, ופרקים בהתאמה.
- עם מלקחיים בLEFיד לא אם החוקר הוא ימני (או ביד ימין אם החוקר הוא שמאלי), לכוון את העובר עם התא של עניין לימין (או לשמאל אם החוקר הוא שמאלי), ו בעדינות לתפוס את העובר בין המלקחיים כדי לייצב אותו.
- באמצעות מחט משכה זכוכית (שלב 1.5 לעיל; איור 4), בעדינות לנקב את התא של עניין. אל תכניס את המחט עמוקה מדי, כדי שלא לדחוף את המחט לתוך תאי שכנים או מתחת לתא של עניין. המחט רק צריכה לנקב את סיסי וקרום תא בסיסי, ואין צורך להאריך עמוק לתוך התא להיות ablated.
- להחליף את המחט נהגה לנקב את העובר לסוף כוס פיפטה בפה עם קנס הוציאה קצה פיפטה פסטר (שלב 1.4 לעיל). החזק את קצה פיפטה כדי לסגור את החור נוצר בתא של עניין, ולהחיל שאיבה עדינה מאוד.
- מאוד ללחוץ בעדינות את העובר עם המלקחיים. כמו התוכן של blastoסתם נדחף אל מחוץ לסיסי דרך החור שנוצר בשלב 4.4, למצוץ אותו לתוך פיפטה הפה כדי לאפשר מבט פתוח של העובר. אם החור גדול מספיק, גרעין התא ניקב ניתן לראות לצוץ גם כן. זו בדיקה טובה כדי לוודא את תוכן התא כולו הוסר, ולא יכול להיות מחדש.
- אנא קראו בעיון את העובר כblastomere של עניין מוסר. הגבול של התא ניקב יהיה לסגת לעבר החור בסיסי, מה שהופך את צמתים של תאי הבסיס נראים לעין. המשך להפעיל לחץ עד שכל blastomere עניין הוסר. שימוש במלקחיים לגלגל את העובר מצד לצד וחזותי לאשר כי כל blastomere של עניין הוא נעלם.
- באמצעות פיפטה פסטר 15 סנטימטר ללא שינוי, להעביר את העובר כדי לנקות FASW + (מ"ג FASW + 1 / מיליליטר Amphotericin B, 100 יחידות / מיליליטר פניצילין ו100 מ"ג / מיליליטר סטרפטומיצין).
- הרם עוברים-ablated blastomere בבארות בודדותצלחת 48 היטב נקייה בFASW +, שינוי 50% מFASW-בתוספת האנטיביוטיקה + יומית. בידיים שלנו עוברים לשרוד ולהתפתח היטב, אבלציה אף שלאחר מכן, בטווח של טמפרטורות 18-28 º C. חוקרים צריכים להעלות העוברים שלהם בטמפרטורה אשר יש להם משטח נקי (אך לא בהכרח סטרילי) שעליו להעלות את העוברים עם הפרעה מינימאלית. כדי להיות מסוגל להשוות את העיתוי של אירועים התפתחותיים בעוברים-ablated blastomere עם פקדים, אנחנו מפנים את הקורא למידע היערכות התפתחותית מפורט שזמין עבור עוברים הועלו ב18 º 4 C, C º 25 4, ו26 º C 5,6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בעקבות אבלציה מוצלחת של מחשוף הסינגל השלישי פ micromeres hawaiensis כפי שתואר בפרוטוקול זה, micromeres שנותר לעבור בהדרגה את עמדותיהם במקצת, כדי לכבוש את השטח הכבוש בעבר על ידי blastomere ablated באופן חלקי. לדוגמא, כאשר גרם מוסר, השכנה mr לסטומרים ומ"ל להסיט מעט ובאו לחלוק גבולות תא לרוחב שהיו בעבר בקשר ישיר עם g (השווה איור 2 א ו 2 ג). בעקבות אבלציה מוצלחת, לסטומרים שנותר עשוי להציג עיכוב קל (של פחות משעה) לפני כניסת המחשוף רביעי, אבל הם צריכים אז לחדש את אותם דפוסי מחשוף ועיתוי שהם היו מוצגים בעוברי unmanipulated לפחות עד לשלבי gastrulation 23 . אבלציה הבאה של כל אחד מארבעת micromeres, צאצאיהם של blasto שנותרשכירי חרב צריכה גם להראות עיתוי נורמלי מחשוף והתנהגויות הסלולר, הכוללים השקעה של הסדר הסלולר אופייני מכונה "שושנה 'והחניכה של תנועות gastrulation 23. חלקם של עוברים שישרדו את הליך אבלציה ועובר שלם ועד לבקיעה יכול בתחילה להיות בסדר הגודל של כ -10% לחוקר חדש לטכניקה, אבל עם ניסיון להעלות את ממוצע כ 50%, והוא יכול להיות גבוה ככל 75% עם תרגול וטיפול המשמר של העוברים הבאים אבלציה blastomere. טבלת 1 מציגה דוגמאות של מספרים של עוברי ablated ושיעורי הישרדות עבור סדרה של ניסויי אבלציה הרצופים שבוצעו על ידי אותו חוקר, מראה כי שיעורי הישרדות הם בדרך כלל לפחות 80% לראשונים כמה ימים שלאחר אבלציה, וכי שיעורי הישרדות עד לבקיעת עלייה עם ניסיון גובר של החוקרת.
הסרת blastomere שלמה תהיהשמעיד על ידי רואה שרידי blastomere שהיה צריך ablated, אשר יכול לכלול מרכיבי קרום, ציטופלסמה, או גרגרי חלמון, עדיין נמצא בתוך סיסית של העובר. עיכוב במחשוף הרביעי של יותר משעתיים, או דפוסי מחשוף לא סדירים או התנהגויות הסלולר של צאצאי לסטומרים הנותר, עלול גם להצביע על אבלציה לא מוצלחת. תופעות אלה יכולות להיות התוצאה של נזק שנגרם ללסטומרים אחר במהלך הליך אבלציה. אם לסטומרים אחר מאשר אחד ממוקד למומים מורפולוגיים תצוגת אבלציה או להתפורר, ואז שוב נזק צפוי להיגרם ללסטומרים אחר במהלך הליך אבלציה.
אם סמני גורל התא זמינים לתייג את צאצאי לסטומרים מחשוף שלישי ספציפי גורלם אינם כפופים להחלפה רגולטיביות, ניתן להשיג לאחר מכן אישור נוסף לאבלציה מוצלחת על ידי עוברי תיוג מניפולציות עם אלה סמנים folloאגף אבלציה. סמנים של כמה שטחי mesodermal וectodermal תוארו באמצע לשלבים מאוחרים של עובר 8,14,15. עם זאת, משום ששניהם שכבות הנבט אלה יכולים לעבור החלפה רגולטיביות על אובדנו של אחד מלסטומרים מייסדם 25, סמנים אלה לא יכולים באופן חד משמעי לקבוע אם או לא blastomere אבלציה הייתה מוצלחת. ובמקרה של g מבשר שורת הנבט, כל הצאצאים שלה מסומנים על ידי הביטוי של תמליל Vasa 12 וחלבון 4 לאורך עובר, ועוברים שבגרמו כבר ablated תאי נבט חוסר לפחות עד ללהקה נבט שלבים מוקדמים 4. אבלציה מוצלחת של גר ובכך ניתן לאשר על ידי בחינת ביטוי Vasa הבא אבלציה בשלבים מאוחרים יותר של עובר (איור 5).
ה = "5in 'עבור: src = />" / files/ftp_upload/51073/51073fig1highres.jpg' = "/ files/ftp_upload/51073/51073fig1.jpg 'src
איור 1. מבוגרים Parhyale hawaiensis נשי ועוברים. תצוגה לרוחב של נקבה בוגרת פ () hawaiensis, מראה צלחות coxal (חיצים), תוספות החזי (ראשי חץ) ועוברים גלויים כהספרואידים הוורודים או סגולים דרך הצלחות שקופות coxal (קווי המתאר כחולים מנוקדים). הקדמי הוא בצד השמאל. (ב) להציג הגחון של נקבה בוגרת פ hawaiensis מראה עוברים נראים בכיס הדגירה (המתאר מקווקו כחול). הקדמי הוא בצד השמאל. עוברים (C) שוחררו מכיס הדגירה להתפתח באופן נורמלי בFASW. מגוון רחב של שלבים החל S1 דרך הבקיעה מוצגים, מבוים על פי בראון ואח' בר = 5 מ"מ בקנה מידה 1 ב (א) ו (ב);. 500 מיקרומטר ב( C).51073/51073fig1highres.jpg 'target = "_blank"> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. שמונה עוברי שלב תא של פ hawaiensis. () חיים בשלב שמונה תאים (S4 שלב 5) עובר unmanipulated, הכוללים ארבעה micromeres (תאים קטנים יותר) וארבע macromeres (תאים גדולים יותר). (ב) סכמטי של עובר בשלב שמונה תאים מראים כינויי גורל תא של כל לסטומרים בעובר סוג בר כפי שנחשף על ידי שושלת התחקות מבוססת על סמני ניאון 6. (ג) בשידור חי בשלב עובר S4 כי יש לו blastomere גרם להסיר באמצעות הפרוטוקול הנוכחי. האזור המוקף בעיגול מראה את האזור שנכבש בעבר על ידי blastomere גרם;micromeres שנותר השתנה עמדה מעט כתוצאה מאבלציה של g. סרגל קנה מידה = 250 מיקרומטר ב (א) ו (ג). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. כלי חוט משמש להסרת עוברים מכיס הדגירה. הכלי שמוצג כאן נעשה על ידי החדרת חוט טונגסטן לקצה הצר של פיפטה פסטר ובעדינות המסת הזכוכית כדי לאטום את החוט במקום, ולאחר מכן באמצעות מלקחיים להציג את עקומה עדינה לחוט. כלים אחרים מתאימים להסרת עוברים מכיס הדגירה כוללים מלקחיים קהות או נימי זכוכית עם קצה אטום ומוחלק. Scבר אייל = 1 סנטימטר.
איור 4. מחט זכוכית המשמשת לניקוב לסטומרים במהלך הליך אבלציה. המחט שמוצגת כאן הייתה משוכה על חולץ מחט p97 סאטר באמצעות תכנית עם פרמטרים 2 x (חום = 566, למשוך = 100, מהירות = = 250 20, זמן) x + 1 (חום = 566, למשוך = 100, מהירות = 100, זמן = 250). מכשירים או תוכניות אחרים ניתן להשתמש כדי למשוך את המחטים מתאימות לאבלציה, כל עוד הם של אותה הצורה כללית כמו זה שמוצג כאן. סרגל קנה מידה = 1 סנטימטר.
איור 5. הערכת התוצאות של blastomereblation בעובר. (א) באזור בלוטת מין של עובר S29 שלב סוג בר, זמן קצר לפני הבקיעה, מראה בתאי נבט שכותרתו על ידי immunostaining אנטי ושה (ראשי חץ). הנוגדן אנטי Vasa משמש כאן הוא ספציפי לפ hawaiensis ושה (Linsler, Alwes וExtavour, נתונים שלא פורסמו). (ב) באזור בלוטת מין של עובר S29 שלב שהיה לי blastomere גרם הוסר בשלב שמונה תאים, מראה היעדר תאי נבט כפי שנחשף על ידי היעדר האות אנטי Vasa הספציפי באזור בלוטת המין (ראשי החץ). בר סולם ב (א) = 100 מיקרומטר וחל גם על (ב '). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
| סיבוב אבלציה | # Ablated | # (%) שרדלפיתוח 50% | # (%) שרד לפיתוח 90-100% |
| 1 | 49 | 41 (83.7) | 6 (12.2) |
| 2 | 48 | 46 (95.8) | 17 (35.4) |
| 3 | ביום 31 | 25 (80.6) | 22 (71.0) |
| 4 | 97 | 72 (74.2) | 56 (57.7) |
| 5 | 108 | 100 (92.6) | 65 (60.2) |
| 6 | 50 | 36 (72.0) | 37 (74.0) |
| סך הכל | 383 | 320 (83.6) | 203 (53.0) |
טבלת 1. הישרדות אבלציה נציגנתונים סטטיסטיים. בעקבות אבלציה micromere, הישרדות, נכבש גם בתוך 50% הראשונים של פיתוח (5-6 ימים ב25 º C) ולאחר מכן בפיתוח 90-100% (10-12 ימים ב25 מעלות צלזיוס). אבלציה הסיבובים 1-6 הם דוגמאות מייצגות של ניסויים שבוצעו על ידי חוקר יחיד (AR נאסט) בסדר כרונולוגי במשך תקופה של שמונה חודשים. חוקרים צריכים למצוא את זה, כפי שמוצג כאן, שיעורי הישרדות ל90-100% עליית פיתוח עם ניסיון.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אנו מתארים פרוטוקול לאבלציה ידנית וההסרה פיזית מלאה של לסטומרים אחד מהשלבים המוקדמים של מחשוף פ amphipod hawaiensis. אנו מדגימים שימוש בפרוטוקול זה על ידי הסרת תאים גרם מבשר שורת החיידק הבודד מעובר בשלב שמונה תאים, ומראים כי אבלציה הייתה מוצלחת אם תאשר היעדרות של תאי בת של g בעובר מאוחר יותר. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי להסיר כל micromeres מהעובר בשלבים מוקדמים מחשוף. כדי להשתמש בפרוטוקול זה כדי להסיר macromeres בשלב זה, או לסטומרים בשלבי מחשוף ראשון או שני, משתמשים יכולים פשוט להחיל את השינויים קלים של יצירתו של חור גדול במקצת בסיסי בצעד 4.4, והפעלת לחץ ויניקה לזמן ארוך יותר כדי להסיר את הנפח הגדול יותר של תוכן תא בשלב 4.6. מצאנו כי בעקבות שימוש בפרוטוקול זה, פיתוח של לסטומרים שנותר לאחר אבלציה הוא בלתיהשפיע ביחס לדפוסי מחשוף ותנועת תא לפחות עד לזמנו של gastrulation 23.
פרוטוקול זה יכול להיות שימושי עבור חקירה נמשכה גם בפוטנציאל ההתפתחותי של לסטומרים מחשוף בתחילת amphipod זה. שאלות רבות נותרו כדי לקבל תשובה בתחום זה, ובכלל זה מדוע חלק מתאים אך לא לאחרים יכולים לשנות את גורלם כדי להחליף את אלה של לסטומרים ablated, ואת העיתוי ואת המנגנונים המדויקים של שינויי ויסות אלה. הפרוטוקול יכול גם להיות שונה כדי להתאים לאבלציה של יותר מתא אחד, פשוט על ידי חזרה על 4.2-4.7 צעדים ברציפות על לסטומרים של עניין.
חשוב להשתמש בסטראו באיכות גבוהה עם תאורה מתאימה על מנת להציג ולזהות נכון לסטומרים המחשוף המוקדם. אנו מוצאים כי אור לבן לרוחב אירוע ממקור אור הקר סיבים אופטיים הוא שימושי ביותר למטרה זו. אור האירוע ישירות מעל SPECIMen יוצר השתקפויות שיכולות לטשטש את המורפולוגיות וגבולות סלולריות, בעוד שאור מועבר לא מצליח לחדור את החלמון הצפוף של העוברים ולסטומרים לכן קשים להבחין. זה מועיל ביותר לזכוכית שעון או צלחת פטרי המכילה עובר להיות מוצב על משטח שחור ולא משטח זכוכית לבן או שקוף, כמו זה מספק ניגוד הטוב ביותר עבור העוברים החיוורים.
מגבלה אחת לפרוטוקול זה היא שblastomere של עניין חייב להיות בצורה נכונה ובאופן חד משמעי שזוהה לפני תחילת ההליך. טכניקות photoablation תהיה שימושיות יותר לחוקרים חדשים למערכת, שכן ניתן להשאיר את העוברים לפתח במשך כמה מחזורי מחשוף לאחר ההזרקה של צבע פלואורסצנטי 28, ואת זהותו של blastomere הזריק אישרה לאחר הזרקה, אך לפני photoablation, על ידי ניתוח הדפוסים של הצאצאים הסלולריים, שתוארו היטב בשורת תאים הקודמתגיל מנתח 6,23. ברגע שהחוקרים מכירים את פ עובר hawaiensis ויכול לזהות את כל לסטומרים בביטחון, אבלציה במדריך המתוארת כאן יכולה לשמש עבור יישומים בהם הסרה מלאה פיזית של blastomere, ולא להרוג את התא מבלי להסיר את התאים המת מהגוף את העובר, רצויה.
הליך זה יכול באופן עקרוני להיות מיושם כדי להסיר לסטומרים אחד מעוברי שלב מחשוף של סרטנים holoblastically ביקוע אחרים, או חסרי חוליות ימיות או מים מתוקים אחרות שchorions או קרומי הפריה לא ניתן להסיר בקלות. שינויים יכולים לכלול שימוש במדים דגירה עם מאפייני מליחות מתאימים, ושינוי הצורה של המחט כדי להכיל את הקרום עדין יותר (, מחטים ארוכות יותר דקות יותר) או כיסויים עובריים חזקים יותר (קצרות יותר, במהירות מתחדדים מחטים).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים לריחאן עריף וHassaan Shahawy לעבודת מצלמה, טריפטיכון גופטה ופרדריקה Alwes לסיוע שיפור טכניקת אבלציה התא, וחברי המעבדה Extavour למשוב על נתונים, וידאו וכתב היד. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי תאי גזע מכון הרווארד (מספר גרנט זרע SG-0057-10-00) קרן אליסון הרפואית (ניו Scholar פרס מספר AG-NS-07,010-10) לCGE, והפרסים הרווארד תכנית המחקר במכללה ל ARN.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 cm Pasteur pipette | Wheaton | 53499-630 VWR | For transferring intact and blastomere-ablated embryos from dish to dish. |
| 22 cm Pasteur pipette | Wheaton | 53499-632 VWR | For making mouth pipette tips. |
| 3 cm Petri dishes | Thermo Scientific | 25382-334 VWR | Use some unaltered to collect and store embryos; coat some with a layer of Sylgard (see below) to create a working surface for blastomere ablations. |
| 48-well Plates | Greiner Bio-One | 82051-004 VWR | For culturing embryos following ablation. |
| Bottle top filters 0.2 µm | Nalge Nunc International | 28199-296 VWR | For creating FASW (See below). |
| Bunsen burner | VWR | 89038-530 VWR | For creating tungsten wire tool and fine tip of mouth pipette. |
| Diamond scribe | Musco Sports Lighting | 52865-005 VWR | For creating wide-mouthed Pasteur pipettes for collecting couples. |
| Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 Fine Science Tools | For holding anaesthetized females during removal of embryos from brood pouch. These do not have to be fine-tipped Dumont forceps - the tips can be at least as blunt as those of the forceps for which the catalogue number is listed here. |
| Fungizone-Amphotericin B | Sigma | A2942 Sigma Aldrich | Add to FASW to a final concentration of 1 mg/ml, and use this solution to culture blastomere-ablated embryos. |
| Glass capillaries 4 in long, 1/0.58 OD/ID (mm) | World Precision Instruments | 1B100-4 World Precision Instruments | For making needles for puncturing the blastomere to be ablated. |
| Glass watchglass 300 mm diameter | Electron Microscopy Sciences | 70543-30 Electron Microscopy Sciences | For use in removing embryos from the brood pouch of anesthetized females. |
| Instant Ocean Artificial Sea Water (ASW) | Instant Ocean | IS160 Aquatic EcoSystems | Make ASW by dissolving salt in deionized water to a salinity of 1.022-1.024. |
| Instant Ocean Filtered Artificial Sea Water (FASW) | Instant Ocean | IS160 Aquatic EcoSystems | Use 0.2 µm filters to sterilize ASW. Make up in small amounts (< 250 ml) as needed. |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 21905-026 VWR | For safely breaking off the fine end of Pasteur pipettes modified for collecting couples. |
| Mouth pipette adaptor | Drummond Labware | A5177-5EA Sigma Aldrich | Insert the fine pulled Pasteur pipette tip into this end, to be used for removing extruded cell contents during the ablation procedure. |
| Mouth pipette tubing | Aldrich | Z280356 Sigma Aldrich | Cut this to be long enough to comfortably hang around your neck during the ablation procedure. |
| Needle Puller | Sutter Instrument Company | P97 Sutter Instrument Company | For making needles from glass capillaries for puncturing the blastomere to be ablated. |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Mediatech | 45000-650 VWR | Add to FASW to a final concentration of 100 units/ml penicillin and 100 mg/ml streptomycin, and use this solution to culture blastomere-ablated embryos. |
| Rubber bulb | Electron Microscopy Sciences | 100488-418 VWR | For using Pasteur pipettes to transfer embryos from dish to dish. |
| Sylgard 184 | K. R. Anderson, Inc. | NC9659604 Fisher Scientific | Make up according to manufacturer's instructions. Pour a layer 2-5 mm thick into a 3cm petri dish to create a working surface for blastomere ablations. |
| Tungsten wire 0.004 inches diameter | A-M Systems | 719000 A-M Systems | Use this to make a tool for removing embryos from the brood pouch of anaesthetized females. |
References
- Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H.
- Sander, K. Pattern formation in insect embryogenesis: the evolution of concepts and mechanisms. Int. J.Insect Morphol. Embryol. 25, 349-367 (1997).
- Regier, J. C., et al. Arthropod relationships revealed by phylogenomic analysis of nuclear protein-coding sequences. Nature. 463, 1079-1083 (2010).
- Extavour, C. G. The fate of isolated blastomeres with respect to germ cell formation in the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis. Dev. Biol. 277, 387-402 (2005).
- Browne, W. E., Price, A. L., Gerberding, M., Patel, N. H. Stages of embryonic development in the amphipod crustacean, Parhyale hawaiensis. Genesis. 42, 124-149 (2005).
- Gerberding, M., Browne, W. E., Patel, N. H. Cell lineage analysis of the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis reveals an early restriction of cell fates. Development. 129, 5789-5801 (2002).
- Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. Fixation and dissection of Parhyale hawaiensis embryos. Cold Spring Harbor Protoc. 2009, (2009).
- Price, A. L., Patel, N. H. Investigating divergent mechanisms of mesoderm development in arthropods: the expression of Ph-twist and Ph-mef2 in Parhyale hawaiensis. J. Exp. B. Dev. Evol. 310, 24-40 (2008).
- Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. In situ hybridization of labeled RNA probes to fixed Parhyale hawaiensis embryos. Cold Spring Harbor Protoc. 2009, (2009).
- Browne, W. W., Schmid, B. G. M., Wimmer, E. A., Martindale, M. Q. Expression of otd orthologs in the amphipod crustacean, Parhyale hawaiensis. Dev. Genes Evol. 216, 581-595 (2006).
- Prpic, N. M., Telford, M. J. Expression of homothorax and extradenticle mRNA in the legs of the crustacean Parhyale hawaiensis: evidence for a reversal of gene expression regulation in the pancrustacean lineage. Dev. Genes Evol. 218, 333-339 (2008).
- Kizil, G., Havemann, J., Gerberding, M. Germ cells in the crustacean Parhyale hawaiensis depend on Vasa protein for their maintenance but not for their formation. Dev. Biol. 327, 320-239 (2009).
- Liubicich, D. M., et al. Knockdown of Parhyale Ultrabithorax recapitulates evolutionary changes in crustacean appendage morphology. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 13892-13896 (2009).
- Pavlopoulos, A., et al. Probing the evolution of appendage specialization by Hox gene misexpression in an emerging model crustacean. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 13897-13902 (2009).
- Vargas-Vila, M. A., Hannibal, R. L., Parchem, R. J., Liu, P. Z., Patel, N. H. A prominent requirement for single-minded and the ventral midline in patterning the dorsoventral axis of the crustacean Parhyale hawaiensis. Development. 137, 3469-3476 (2010).
- Simanton, W., et al. Conservation of arthropod midline netrin accumulation revealed with a cross-reactive antibody provides evidence for midline cell homology. Evol. Dev. 11, 260-268 (2009).
- Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. Antibody staining of Parhyale hawaiensis embryos. Cold Spring Harbor Protoc. 2009, (2009).
- Pavlopoulos, A., Averof, M. Establishing genetic transformation for comparative developmental studies in the crustacean Parhyale hawaiensis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 7888-7893 (2005).
- Kontarakis, Z., et al. A versatile strategy for gene trapping and trap conversion in emerging model organisms. Development. 138, 2625-2630 (2011).
- Zeng, V., et al. De novo assembly and characterization of a maternal and developmental transcriptome for the emerging model crustacean Parhyale hawaiensis. BMC Genom. 12, 581 (2011).
- Zeng, V., Extavour, C. G. ASGARD: an open-access database of annotated transcriptomes for emerging model arthropod species. Database. , (2012).
- Nestorov, P., Battke, F., Levesque, M. P., Gerberding, M. The Maternal Transcriptome of the Crustacean Parhyale hawaiensis Is Inherited Asymmetrically to Invariant Cell Lineages of the Ectoderm and Mesoderm. PLoS ONE. 8, (2013).
- Alwes, F., Hinchen, B., Extavour, C. G. Patterns of cell lineage, movement, and migration from germ layer specification to gastrulation in the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis. Dev. Biol. 139, 110-123 (2011).
- Ewen-Campen, B., Schwager, E. E., Extavour, C. G. The molecular machinery of germ line specification. Mol. Reprod. Dev. 77, 3-18 (2010).
- Price, A. L., Modrell, M. S., Hannibal, R. L., Patel, N. H. Mesoderm and ectoderm lineages in the crustacean Parhyale hawaiensis display intra-germ layer compensation. Dev. Biol. 341, 256-266 (2010).
- Fraser, S. E., Harland, R. M. The molecular metamorphosis of experimental embryology. Cell. 100, 41-55 (2000).
- Olsson, L. A clash of traditions: the history of comparative and experimental embryology in Sweden as exemplified by the research of Gösta Jägersten and Sven Hörstadius. Theory Biosci. 126, 117-129 (2007).
- Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. Injection of Parhyale hawaiensis blastomeres with fluorescently labeled tracers. Cold Spring Harbor Protoc. 2009, (2009).
- Chaw, R., Patel, N. H. Independent migration of cell populations in the early gastrulation of the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis. Dev. Biol. 371, 94-109 (2012).
- Schmitz, E. H. Crustacea Microscopic Anatomy of Invertebrates. Microscopic Anatomy of Invertebrates. Harrison, F. W. 9, Wiley-Liss, Inc.. 443-528 (1992).
