高スループット/高含有スクリーニングに適応した細胞内マイコバクテリアの定量化のための顕微鏡表現型アッセイ
Summary
ここでは、小干渉合成RNA(siRNA)、化学化合物、および 結核 菌変異体ライブラリーのハイスループット/高含有スクリーンに適用可能な表現型アッセイについて述べている。この方法は、自動共焦点顕微鏡を用いた蛍光標識された宿主細胞内の蛍光標識型 結核 の検出に依存している。
Abstract
治療とワクチンが利用できるにもかかわらず、結核(TB)は世界で最も致命的で広範囲にわたる細菌感染症の1つです。数十年以来、多剤および広範囲に薬剤耐性株の突然のバーストは、結核の制御のための深刻な脅威です。そのため、結核の原因 物質である結核 菌(Mtb)にとって重要な新しい標的や経路を特定し、結核薬となりうる新しい化学物質を探ることが不可欠です。1つのアプローチは、干し草の山で針の検索を可能にする大規模なライブラリの遺伝的および化学的スクリーンに適した方法を設定することです。そのために、自動共焦点顕微鏡を用いて蛍光標識された宿主細胞内で蛍光標識 Mtb を検出することに頼る表現型アッセイを開発しました。この インビトロ アッセイは 、Mtbのホストへのコロニー形成プロセスの画像ベースの定量化を可能にし、siRNA-、化学化合物、または Mtb 変異体ライブラリのスクリーンに適した384ウェルマイクロプレート形式に最適化されました。その後、画像はマルチパラメトリック分析のために処理され、宿主細胞内の Mtbの病因に関する読み取り結果を提供します。
Introduction
過去数年間に報告された新興および再興性感染病原体の中で、結核菌(Mtb)は、2011年に140万人の死亡と870万人の新しい感染症の原因となる著名な場所を保持しています(世界結核レポート2012、www.who.int/topics/tuberculosis/en/)。多剤療法の利用可能性にもかかわらず、感染者数は依然として増加しており、多剤耐性(MDR)ならびに広範囲に薬剤耐性(XDR)Mtbは急速に世界中に広がっている1。また、Mtb抗原の存在を考慮すると、全世界の人口の3分の1がMtbによって潜感染していると考えられることは明らかである。したがって、Mtbと戦う新しい手段が緊急に必要とされています。この文脈で、我々は、自動共焦点蛍光顕微鏡3によるMtbの浸潤および増殖を宿主細胞に監視することに頼るインビトロ視覚表現型アッセイを開発した。384ウェルマイクロタイタープレートでのアッセイの適応は、自動画像取得および分析と組み合わせて、化合物、siRNAおよび細菌変異体の中規模ライブラリーの高含有量/ハイスループットスクリーニング(HC/HTS)を可能にした。この表現型アッセイに関するゲノムワイドRNAiライブラリのスクリーニングにより、Mtb人身売買や細胞内複製に関与する主要な宿主因子の同定が可能になっただけでなく、結核菌によって悪用される宿主経路の解明も可能になった。この特定の表現形学アッセイのもう一つの適応は、Mtbの食前体内持続性に不可欠な細菌因子の同定であった。例えば、ファゴソーム成熟の逮捕は、マクロファージにおけるMtbの生存および複製を促進する主要なメカニズムの1つと考えられている。蛍光標識酸性コンパートメントにおけるMtbノックアウト変異体の細胞内局在のモニタリングにより、生存プロセス4に関与する細菌遺伝子の同定が可能となった。最後に、Mtbの高含有イメージングは、細胞内細菌増殖などの様々な現象を阻害するための薬剤効率を定量化する優れた方法も提供する3。全体として、このタイプの高スループット表現型アッセイは、結核に対する創薬を加速することを可能にし、これらの異なるアプローチによって収集されたデータは、Mtbによって行われるホスト操作のより良い理解に寄与する。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、蛍光標識された宿主細胞に感染するためにGFP発現 Mtb H37Rv株を用いた表現型アッセイに必要な方法を説明し、高含有量/ハイスループットスクリーンに適しています。このプロトコルは、広範囲の化合物、蛍光プローブおよび Mtb 変異体に適用することができる。上述した各プロトコルについて、画像取得前に固定および免疫標識のステップを行うことができた。20X(NA 0….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作業に対する財政的支援は、欧州共同体(ERC-STG INTRACELLTBグラントn°260901、MM4TBグラントn°260872)、アジェンス・ナショナル・ド・レシェルシュ、フェダー(12001407(D-AL)エクイペックス・イマジックス・バイオメッド)、および地域ノルド・パ・ド・カレーによって提供されました。私たちは、プラットフォームBICeLからガスパール・デロイソン、エリザベス・ヴェルクマイスター、アントニーノ・ボンジョヴァンニ、フランク・ラフォントの技術支援を感謝しています。
Materials
| µclear-plate black, 384 well | Greiner bio-one | 781091 | 127.8/86/15 MM with Lid, TC treated |
| CellCarrier 384 well plate | PerkinElmer | 6007550 | Black, Clear Bottom, with Lid, TC treated |
| V-bottom white , 384 well-plate | Greiner bio-one | 781280 | |
| sealing tape, breathable, sterile | Corning | 3345 | |
| Lipofectamine RNAiMax | Life Technologies | 13778150 | Transfection reagent |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 34943 | |
| RPMI 1640 + GlutaMAX-I | Life Technologies | 61870-010 | Cell culture medium |
| D-PBS 1X [-]MgCl2/[-]CaCl2 | Life Technologies | 14190-094 | Dulbecco's Phosphate Salin Buffer |
| D-PBS 1X [+]MgCl2/[+]CaCl2 | Life Technologies | 14190-091 | Dulbecco's Phosphate Salin Buffer |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 2610040-79 | |
| FICOLL PAQUE PLUS | DUTSCHER | 17-1440-03 | Ficoll for Peripherical Blood Monocyte Cells purification |
| CD14 MicroBeads, human | Miltenyi | 130-050-201 | Purification of CD14+ Monocytes |
| Human M-CSF, premium gr. (1000 μg) | Miltenyi | 130-096-493 | Macrophage Colony Stimulating Factor |
| LS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | Columns for CD14+ Monocytes isolation |
| Tween 80 | Euromedex | 2002-A | Mycobacteria culture |
| Glycerol high purity | Euromedex | 50405-EX | Mycobacteria culture |
| Middlebrook OADC enrichment | Becton-Dickinson | 211886 | Mycobacteria culture |
| 7H9 | Becton-Dickinson | W1701P | Mycobacteria culture |
| Versene 1X | Life Technologies | 15040033 | Non enzymatic cell dissociation solution |
| DAPI | Life Technologies | D1306 | Nuclei dye |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | Nuclei dye |
| Syto60 | Life Technologies | S11342 | Nuclei/cytoplasm dye |
| Formalin | Sigma-Aldrich | HT5014 | Cell fixation solution |
| siRNA targeting Dectin-1 | Santa-Cruz | sc-63276 | |
| *siGenome* Non targeted siRNA pool | Dharmacon | D-001206-14 | |
| Rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501 | antibiotic |
| Isoniazid (INH) | Sigma-Aldrich | I3377-50G | antibiotic |
| Hygromycin B | Life Technologies | 10687-010 | antibiotic |
| Amikacin | Sigma-Aldrich | A1774 | antibiotic |
| Automated Confocal Microscope OPERA | PerkinElmer | Image acquisition | |
| Columbus 2.3.1 Server Database | PerkinElmer | Data transfert, storage and analysis | |
| Acapella 2.6 software | PerkinElmer | Image-based analysis | |
| GraphPad Prism5 software | GraphPad | Statistical analysis | |
| Excel 2010 | Microsoft | Statistical analysis |
References
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