ताजा सर्जिकल नमूने से अलगाव और मानव निलय cardiomyocytes की कार्यात्मक विशेषता
Summary
हृदय रोगों के सेलुलर आधार पर वर्तमान ज्ञान ज्यादातर पशु मॉडलों पर अध्ययन पर निर्भर करता है. यहाँ हम का वर्णन है और मानव निलय मायोकार्डियम के छोटे शल्य चिकित्सा नमूने से एक व्यवहार्य cardiomyocytes प्राप्त करने के लिए एक उपन्यास विधि मान्य. मानव निलय myocytes electrophysiological अध्ययन और नशीली दवाओं के परीक्षण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Abstract
रोगग्रस्त दिल से cardiomyocytes कोशिका की संरचना में परिवर्तन, उत्तेजना संकुचन युग्मन और झिल्ली आयन धाराओं को शामिल जटिल remodeling प्रक्रियाओं के अधीन हैं. उन परिवर्तनों वृद्धि हुई arrhythmogenic जोखिम और हृदय रोगियों में सिस्टोलिक और डायस्टोलिक में शिथिलता के लिए अग्रणी सिकुड़ा परिवर्तन के लिए जिम्मेदार होने की संभावना है. हालांकि, हृदय रोगों में myocyte समारोह के परिवर्तन पर सबसे अधिक जानकारी पशु मॉडल से आ गया है.
यहाँ हम का वर्णन है और हृदय की सर्जरी आपरेशन के दौर से गुजर रोगियों से निलय मायोकार्डियम के छोटे शल्य नमूनों से व्यवहार्य myocytes अलग करने के लिए एक प्रोटोकॉल मान्य. प्रोटोकॉल में विस्तार से वर्णन किया गया है. Electrophysiological और intracellular कैल्शियम माप इस विधि के साथ प्राप्त मानव निलय cardiomyocytes में एकल कक्ष माप की एक संख्या की व्यवहार्यता का प्रदर्शन करने के लिए रिपोर्ट कर रहे हैं.
प्रोटोकॉल वह रिपोर्टRe विभिन्न हृदय रोगों की उपस्थिति में मानव हृदय के कार्यात्मक परिवर्तन के सेलुलर और आणविक आधार की भविष्य में जांच के लिए उपयोगी हो सकता है. इसके अलावा, इस विधि सेलुलर स्तर पर उपन्यास चिकित्सकीय लक्ष्यों की पहचान करने के लिए और प्रत्यक्ष translational मूल्य के साथ, मानव cardiomyocytes पर नए यौगिकों के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Introduction
मायोकार्डियम के electrophysiological गुणों के विच्छेदन एक हृदय myocyte अलगाव के लिए तकनीक के विकास के बाद स्पष्ट रूप से प्रगति की है. हृदय उत्तेजना संकुचन युग्मन (ईसी-युग्मन) की समझ में हाल की प्रगति में भी बरकरार ऊतक के सभी शारीरिक गुणों को बनाए रखने कि व्यवहार्य एकल cardiomyocytes अलग करने की क्षमता से संभव बनाया गया है. पैच दबाना तरीकों नियमित हृदय sarcolemmal आयन धाराओं के समारोह और औषधीय मॉडुलन अध्ययन करने के लिए कार्यरत हैं. सीए 2 + संवेदनशील रंगों के साथ intracellular कैल्शियम की गतिशीलता की रिकॉर्डिंग भी नियमित रूप से चुनाव आयोग युग्मन के शरीर क्रिया विज्ञान पर और साथ ही intracellular सीए 2 + का रोग परिवर्तन पर महत्वपूर्ण डेटा प्रदान करने, स्वस्थ और रोगग्रस्त मॉडल की एक किस्म से ही हृदय myocytes पर प्रदर्शन कर रहे हैं यांत्रिक परेशानी होती है और हृदय रोगों में वृद्धि हुई arrhythmogenic बोझ के लिए अग्रणी होमियोस्टेसिस. सूचनाइन अध्ययनों से tion नैदानिक सेटिंग में दवाओं की electrophysiological और यांत्रिक प्रभाव को समझने के लिए महत्वपूर्ण है. हालांकि, transmembrane धाराओं में और हृदय की कार्य क्षमता और हृदय यांत्रिकी के विशिष्ट सुविधाओं के लिए खाते में है कि चुनाव आयोग युग्मन प्रोटीन में प्रजातियों विशिष्ट मतभेद हैं. गैर मानव स्तनधारियों से अलग myocytes की पढ़ाई biophysical गुणों और विशिष्ट transmembrane आयन चैनल और चुनाव आयोग युग्मन प्रोटीन की शारीरिक भूमिकाओं को स्पष्ट कर दिया है, जबकि इस प्रकार, वे आवश्यक रूप से मानव हृदय myocytes की प्रासंगिक मॉडल प्रदान नहीं करते हैं. मानव मायोकार्डियम से व्यवहार्य myocytes के अलगाव पूरी तरह से हृदय रोगों के pathophysiology को समझने और उपन्यास चिकित्सकीय दृष्टिकोण को मान्य करने के लिए इसलिए जरूरी है.
आलिंद उपांग अक्सर सर्जिकल प्रक्रियाओं के दौरान खारिज कर रहे हैं के रूप में मानव आलिंद ऊतक आसानी से उपलब्ध है. वयस्क मानव हृदय कार्रवाई क्षमता और आयनिक घन की प्रारंभिक मात्रात्मक पढ़ाईrrents enzymatically पृथक आलिंद कोशिकाओं 1-4 कार्यरत हैं. कार्रवाई क्षमता या पृथक वयस्क मानव निलय कोशिकाओं से धाराओं की रिकॉर्डिंग बाद में 3,5-10 सूचित किया गया है. इन अध्ययनों से अधिकांश explanted दिलों से प्राप्त की है और अलग कक्षों प्राप्त करने के लिए collagenase के लिए एक कोरोनरी धमनी खंड या excised ऊतक के अपेक्षाकृत बड़ी मात्रा के जोखिम के collagenase छिड़काव या तो उपयोग कोशिकाओं का इस्तेमाल किया है. इन अध्ययनों से स्वस्थ दिल से मानव निलय cardiomyocytes से और टर्मिनल दिल की विफलता के साथ रोगियों से transmembrane आयन धाराओं के एक नंबर की एक विस्तृत विशेषताओं की अनुमति दी. एल प्रकार की रिकॉर्डिंग सीए 2 + (वर्तमान मैं CA-एल) 5-7, क्षणिक जावक पोटेशियम वर्तमान (मैं) 8, शुद्ध पोटेशियम वर्तमान आवक (मैं κ1) 8, देरी करनेवाला पोटेशियम वर्तमान के विभिन्न घटकों (मैं κ ) 9 सूचित किया गया है. अग्रिम और शोधन कीअलगाव की प्रक्रिया 10,, कार्रवाई संभावित मोहलत 11 शामिल टर्मिनल दिल विफलता, में वृद्धि हुई arrhythmogenic क्षमता का आयनिक आधार का स्पष्ट लक्षण वर्णन अनुमति दी depolarizations 12 के बाद देरी और डायस्टोलिक विध्रुवण और समयपूर्व धड़कता प्रमुख अजीब मौजूदा 13 की वृद्धि हुई.
सेक्स हृदय myocytes सामान्य रूप से विभिन्न एंजाइम मिश्रण के साथ पूरे दिल, सीए 2 + सहिष्णु 14 कोशिकाओं की उच्च पैदावार का उत्पादन एक तकनीक का प्रतिगामी छिड़काव द्वारा छोटे जानवरों से अलग कर रहे हैं. ऊतक के टुकड़े से हृदय myocytes के अलगाव शायद क्योंकि कोरोनरी धमनियों का छिड़काव करके हासिल की है कि के साथ तुलना में व्यक्तिगत myocytes एंजाइमों की सीमित पहुंच के स्वाभाविक रूप से कम सफल है. क्योंकि अप्रयुक्त दाता दिल के बहुत सीमित उपलब्धता की, एक नियमित आधार पर सामान्य मानव निलय कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए केवल व्यावहारिक रास्ता एंजाइमी digestio से हैवैकल्पिक शल्य प्रक्रिया के दौरान excised अक्सर बहुत छोटे ऊतक टुकड़े के एन. अच्छी तरह से सेल स्तर पर होती है कि केवल मानव रोग मॉडल प्रत्यारोपित दिल तक पहुँच के कारण टर्मिनल दिल की विफलता है. हालांकि, टर्मिनल दिल विफलता रोगियों के एक अल्पमत में होता है और अक्सर अंतर्निहित कारण 15 से अपेक्षाकृत स्वतंत्र है जो मायोकार्डियल कोशिकाओं की गंभीर remodeling, के एक आम मार्ग शामिल है. रोग के पहले के एक गैर नाकाम रहने चरण में रोगियों से एकल cardiomyocytes के समारोह का आकलन करने की क्षमता अलग विरासत में मिला है या अर्जित की स्थिति के विशिष्ट pathophysiology को समझने के लिए महत्वपूर्ण है. Hypertrophic cardiomyopathy (HCM) एक कह उदाहरण है. HCM एक सामान्य (1/500 व्यक्तियों) हृदय अतिवृद्धि द्वारा विशेषता दाय हृदय हालत की वजह से बहिर्वाह पथ बाधा और diastolic रोग से 16 arrhythmogenic जोखिम और सिकुड़ा परिवर्तन वृद्धि हुई है. HCM दिल से cardiomyocytes Uसेल संरचना में परिवर्तन (अतिवृद्धि, myofibrillar अव्यवस्था) और चुनाव आयोग युग्मन 17 से जुड़े एक जटिल remodeling प्रक्रियाओं ndergo. हालांकि, हो ची मिन्ह में myocyte रोग के सबसे अधिक जानकारी ट्रांसजेनिक पशु मॉडल से आ गया है. HCM रोगियों के केवल एक अल्पसंख्यक टर्मिनल दिल की विफलता की ओर विकसित और हृदय प्रत्यारोपण की आवश्यकता है, हो ची मिन्ह दिलों मानक तरीकों के साथ सेल अलगाव के लिए बहुत मुश्किल से ही उपलब्ध हैं. हालांकि, हो ची मिन्ह के रोगियों के कम से कम 30% प्रकुंचन (HCM) 18 के दौरान बड़े पैमाने पर सेप्टल अतिवृद्धि फेरबदल बहिर्वाह पथ रक्त प्रवाह के कारण प्रतिरोधी लक्षण विकसित. हो ची मिन्ह में बाधा के राहत के लिए सबसे प्रभावी उपलब्ध चिकित्सकीय विकल्प शल्य सेप्टल myectomy है: इस शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया के दौरान, ऊपरी पट की एक चर आकार भाग ट्रांस महाधमनी दृष्टिकोण से निकाल दिया जाता है. Hypertrophied पट के इस हिस्से को ताजा ऊतक से सेल अलगाव के लिए इसलिए उपलब्ध है.
मानव ventricula के अलगाव के लिए एक विधिआर एकल, छोटे ट्रांसवेनस endomyocardial बायोप्सी नमूनों से myocytes पहले से विकसित और 19 प्रकाशित किया गया है. हम सेप्टल myectomy और वाल्व प्रतिस्थापन प्रक्रियाओं के दौर से गुजर रोगियों के दौर से गुजर HCM के साथ रोगियों सहित हृदय शल्य चिकित्सा के दौर से गुजर रोगियों से निलय मायोकार्डियम के नमूनों से ही सेप्टल myocytes अलग करने के लिए एक विधि लागू. अलगाव प्रोटोकॉल, प्रतिनिधि electrophysiological और सीए 2 + प्रतिदीप्ति का विस्तृत विवरण के अलावा माप पृथक मानव निलय myocytes की व्यवहार्यता और पैच दबाना और intracellular सीए 2 + पढ़ाई की व्यवहार्यता का प्रदर्शन, प्रस्तुत कर रहे हैं.
Protocol
Representative Results
Discussion
हम वर्णित और मानव निलय मायोकार्डियम की शल्य चिकित्सा के नमूनों से व्यवहार्य myocytes अलग करने के लिए एक विधि पुष्टि की है. सफलतापूर्वक रोगग्रस्त निलय मायोकार्डियम से एक व्यवहार्य myocytes की जुदाई विकसित की है ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम के लिए यूरोपीय संघ (strep परियोजना 241,577 "बड़ा दिल," 7 यूरोपीय फ्रेमवर्क कार्यक्रम, सीपी), Menarini अंतर्राष्ट्रीय संचालन लक्समबर्ग (पूर्वाह्न), Telethon GGP07133 (सीपी) और गिलाद विज्ञान (पूर्वाह्न) द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P9791 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate(MgSO4 * 7H2O) | Sigma-Aldrich | M1880 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Adenosine | Sigma-Aldrich | A9251 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Mannitol | Sigma-Aldrich | M4125 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | P5958 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Potassium bicarbonate (KHCO3) | Sigma-Aldrich | 237205 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| Sodium hydroxide(NaOH) | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| L-Glutamic acid monopotassium salt monohydrate | Sigma-Aldrich | 49601 | |
| Pyruvic acid | Sigma-Aldrich | 107360 | |
| 3-Hydroxybutyric acid | Sigma-Aldrich | 166898 | |
| Adenosine 5′-triphosphate dipotassium salt dihydrate (K2-ATP) | Sigma-Aldrich | A8937 | |
| Creatine | Sigma-Aldrich | C0780 | |
| Succinic Acid | Sigma-Aldrich | S3674 | |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E0396 | |
| Albumin from bovine serum | Sigma-Aldrich | A0281 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Type V | Sigma-Aldrich | C9263 | |
| Proteinase, Bacterial, Type XXIV | Sigma-Aldrich | P8038 | |
| Calcium chloride solution, ~1 M in H2O | Sigma-Aldrich | 21115 | |
| Calcium chloride 0.1 M solution | Sigma-Aldrich | 53704 | |
| Potassium methanesulfonate | Sigma-Aldrich | 83000 | |
| FluoForte Reagent | Enzo Life Sciences | ENZ-52015 | |
| Powerload concentrate, 100X | Life Technologies | P10020 | |
| Perfusion Fast-Step System | Warner Instruments | VC-77SP | |
| Amphotericin B solubilized | Sigma-Aldrich | A9528 | |
| Multiclamp 700B patch-clamp amplifier | Molecular Devices | ||
| Digidata 1440A | Molecular Devices | ||
| pClamp10.0 | Molecular Devices | ||
| Digestion Device | CUSTOM | CUSTOM | The device is custome made in our laboratory using plastic tubes, cast Sylgard and a motor; it is described in detail in Fig 1 C-D and in Fig.7. We can provide further details if requested |
| Silicone elastomer for the digestion device's brushes | Dow Corning | SYLGARD® 184 | |
| Variable speed rotating motor for the digestion device | Crouzet | Crouzet 178-4765 | |
| Mold for brushes casting | N.A. | N.A. | The mold is custom made from standard PTFE 2.5 cm diameter rods |
References
- Dow, J. W., Harding, N. G., Powell, T. Isolated cardiac myocytes. I. Preparation of adult myocytes and their homology with the intact tissue. Cardiovascular Research. 15, 483-514 (1981).
- Dow, J. W., Harding, N. G., Powell, T. Isolated cardiac myocytes. II. Functional aspects of mature cells. Cardiovascular Research. 15, 549-579 (1981).
- Harding, S. E., et al. Species dependence of contraction velocity in single isolated cardiac myocytes. Cardioscience. 1, 49-53 (1990).
- Bustamante, J. O., Watanabe, T., Murphy, D. A., McDonald, T. F. Isolation of single atrial and ventricular cells from the human heart. Canadian Medical Association Journal. 126, 791-793 (1982).
- Beuckelmann, D. J., Nabauer, M., Erdmann, E. Characteristics of calcium-current in isolated human ventricular myocytes from patients with terminal heart failure. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 23, 929-937 (1991).
- Beuckelmann, D. J., Nabauer, M., Erdmann, E. Intracellular calcium handling in isolated ventricular myocytes from patients with terminal heart failure. Circulation. 85, 1046-1055 (1992).
- Cohen, N. M., Lederer, W. J. Calcium current in single human cardiac myocytes. Journal of Cardiovascular Electrophysiology. 4, 422-437 (1993).
- Beuckelmann, D. J., Nabauer, M., Erdmann, E. Alterations of K+ currents in isolated human ventricular myocytes from patients with terminal heart failure. Circulation Research. 73, 379-385 (1993).
- Virag, L., et al. The slow component of the delayed rectifier potassium current in undiseased human ventricular myocytes. Cardiovascular Research. 49, 790-797 (2001).
- Nanasi, P. P., Varro, A., Lathrop, D. A. Isolation of human ventricular and atrial cardiomyocytes: technical note. Cardioscience. 4, 111-116 (1993).
- Benitah, J. P., et al. Slow inward current in single cells isolated from adult human ventricles. Pflugers Archiv. European Journal of Physiology. 421, 176-187 (1992).
- Verkerk, A. O., et al. Ionic mechanism of delayed afterdepolarizations in ventricular cells isolated from human end-stage failing hearts. Circulation. 104, 2728-2733 (2001).
- Cerbai, E., et al. Characterization of the hyperpolarization-activated current, I(f), in ventricular myocytes from human failing heart. Circulation. 95, 568-571 (1997).
- Kohncke, C., et al. Isolation and kv channel recordings in murine atrial and ventricular cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2013).
- Tomaselli, G. F., Marban, E. Electrophysiological remodeling in hypertrophy and heart failure. Cardiovascular Research. 42, 270-283 (1999).
- Maron, B. J. Hypertrophic cardiomyopathy: a systematic review. JAMA: The Journal of the American Medical Association. 287, 1308-1320 (2002).
- Olivotto, I., et al. The many faces of hypertrophic cardiomyopathy: from developmental biology to clinical practice. Journal of Cardiovascular Translational Research. 2, 349-367 (2009).
- Maron, M. S., et al. Hypertrophic cardiomyopathy is predominantly a disease of left ventricular outflow tract obstruction. Circulation. 114, 2232-2239 (2006).
- Peeters, G. A., et al. Method for isolation of human ventricular myocytes from single endocardial and epicardial biopsies. The American Journal of Physiology. 268, 1757-1764 (1995).
- Lippiat, J. D. Whole-cell recording using the perforated patch clamp technique. Methods Mol Biol. 491, 141-149 (2008).
- Coppini, R., et al. Late sodium current inhibition reverses electromechanical dysfunction in human hypertrophic cardiomyopathy. Circulation. 127, 575-584 (2013).
- Kuusisto, J., et al. Low-grade inflammation and the phenotypic expression of myocardial fibrosis in hypertrophic cardiomyopathy. Heart. 98, 1007-1013 (2012).
- Yan, G. X., et al. Phase 2 early afterdepolarization as a trigger of polymorphic ventricular tachycardia in acquired long-QT syndrome : direct evidence from intracellular recordings in the intact left ventricular wall. Circulation. 103, 2851-2856 (2001).
- Yue, L., Feng, J., Li, G. R., Nattel, S. Transient outward and delayed rectifier currents in canine atrium: properties and role of isolation methods. The American Journal of Physiology. 270, 2157-2168 (1996).
- Li, G. R., Feng, J., Yue, L., Carrier, M., Nattel, S. Evidence for two components of delayed rectifier K+ current in human ventricular myocytes. Circulation research. 78, 689-696 (1996).
- Viswanathan, P. C., Shaw, R. M., Rudy, Y. Effects of IKr and IKs heterogeneity on action potential duration and its rate dependence: a simulation study. Circulation. 99, 2466-2474 (1999).
- Volders, P. G., et al. Probing the contribution of IKs to canine ventricular repolarization: key role for beta-adrenergic receptor stimulation. Circulation. 107, 2753-2760 (2003).
- Sanguinetti, M. C., Jurkiewicz, N. K., Scott, A., Siegl, P. K. Isoproterenol antagonizes prolongation of refractory period by the class III antiarrhythmic agent E-4031 in guinea pig myocytes. Mechanism of action. Circulation Research. 68, 77-84 (1991).
- Coppini, R., et al. A translational approach to treatment of hypertrophic cardiomyopathy: pre-clinical rationale and design of a prospective randomized pilot trial with ranolazine. Circulation. 125, 1 (2012).
