Isolatie en functionele karakterisering van Human ventriculaire cardiomyocyten van Fresh Chirurgische Samples

Summary

Huidige kennis over de cellulaire basis van hartziektes vertrouwt vooral op studies op diermodellen. Hier beschrijven we en validatie van een nieuwe methode om enkele levensvatbare hartspiercellen te verkrijgen van kleine chirurgische monsters van menselijk ventriculair myocard. Menselijke hartspiercellen en kan worden gebruikt voor elektrofysiologische studies en drugstesten.

Abstract

Hartspiercellen van zieke harten zijn onderworpen aan complexe verbouwing processen waarbij veranderingen in de celstructuur, excitatie contractie koppeling en membraan ion stromingen. Deze veranderingen zijn waarschijnlijk verantwoordelijk voor het verhoogde risico aritmogene en contractiele wijzigingen waardoor systolische en diastolische disfunctie bij hartpatiënten zijn. Echter, de meeste informatie over de wijzigingen van myocyte functie in hartziekten is afkomstig van diermodellen.

Hier beschrijven we en valideren van een protocol om levensvatbare myocytes isoleren van kleine chirurgische monsters van ventriculaire myocardium van patiënten die een hartoperatie operaties. Het protocol wordt beschreven. Elektrofysiologische en intracellulair calcium metingen worden gerapporteerd aan de haalbaarheid van een enkele cel metingen in humane ventriculaire cardiomyocyten verkregen met deze werkwijze tonen.

Het protocol meldde hijre kan nuttig zijn voor toekomstige onderzoeken van de cellulaire en moleculaire basis van functionele veranderingen van het menselijke hart in de aanwezigheid van verschillende hartziekten zijn. Verder kan deze methode worden gebruikt om nieuwe therapeutische targets op cellulair niveau te identificeren en de effectiviteit van nieuwe verbindingen te testen op menselijke cardiomyocyten, directe translationele waarde.

Introduction

Dissectie van de elektrofysiologische eigenschappen van het myocard heeft na de ontwikkeling van technieken voor enkele hartspiercel isolatie aanzienlijk gevorderd. Recente ontwikkelingen in het begrijpen van cardiale Excitatie contractiekoppeling (EG-koppeling) zijn ook mogelijk gemaakt door het vermogen isoleren levensvatbare enkele cardiomyocyten dat alle fysiologische eigenschappen van het intacte weefsel behouden. Patch clamp methoden worden routinematig gebruikt om de functie en farmacologische modulatie van cardiale sarcolemmale ionstromen bestuderen. Opnamen van intracellulair calcium dynamiek ^{Ca2 +} gevoelige kleurstoffen worden regelmatig uitgevoerd in enige cardiale myocyten uit verschillende gezonde en zieke modellen, waarbij het ​​belangrijke gegevens over de fysiologie van EG-koppeling en op de pathologische veranderingen van intracellulaire ^{Ca2 +} homeostase leidt tot mechanische stoornissen en verhoogde aritmogeen lasten op hartziekten. Informatie van deze studies is cruciaal voor het begrijpen van de elektrofysiologische en mechanische effecten van geneesmiddelen in de klinische setting. Er zijn soortspecifieke verschillen in de transmembraan stromen en de EG-koppeling eiwitten die verantwoordelijk zijn voor specifieke kenmerken van cardiale actiepotentiaal en cardiale mechanica. Dus, terwijl studies van myocytes geïsoleerd van niet-menselijke zoogdieren de biofysische eigenschappen en fysiologische rol van specifieke transmembraan ionkanalen en EG-Koppeling eiwitten hebben opgehelderd, zij niet noodzakelijkerwijs relevante modellen van menselijke hartspiercellen. Isolatie van levensvatbare myocytes van menselijke hartspier is daarom essentieel om volledig te begrijpen van de pathofysiologie van hart-en vaatziekten en valideren van nieuwe therapeutische benaderingen.

Menselijke atriaal weefsel beschikbaar atriale aanhangsels vaak tijdens chirurgische procedures worden verwijderd. Initiële kwantitatieve studies van volwassen menselijke cardiale actiepotentialen en ionische currents werkzaam enzymatisch geïsoleerde atriale cellen ^1-4. Opnames van actiepotentialen of stromen van geïsoleerde menselijke ventriculaire cellen volwassen zijn vervolgens gerapporteerd ^3,5-10. De meeste van deze studies gebruikte cellen verkregen uit geëxplanteerde harten en gebruikt hetzij collagenase perfusie van een kransslagader segment of blootstelling van relatief grote hoeveelheden weggesneden weefsel collagenase geïsoleerde cellen te verkrijgen. Deze studies kon een gedetailleerde karakterisering van een aantal transmembraan ionstromen van humane ventriculaire cardiomyocyten van gezonde hart en patiënten met terminale hartfalen. Opnamen van L-type ^{Ca2 +} (I _Ca-L) ^5-7, voorbijgaande buitenwaartse kaliumstroom _(I) ⁸ binnenwaartse kaliumstroom (I _κ1) ^8, de verschillende componenten van vertraagde gelijkrichter kalium (I _κ ) ⁹ gemeld. Voorschotten en raffinage vande isolatie procedure ^10, kon een duidelijk karakterisering van de ionische basis van de toegenomen arrhythmogenic potentieel in terminal hartfalen, bestaande uit actiepotentiaal verlenging ^11, vertraagd na depolarisaties ¹² en verhoogde grappige huidige ¹³ leidt tot diastolische depolarisatie en premature slagen.

Volwassen hartspiercellen gewoonlijk geïsoleerd uit kleine dieren door retrograde perfusie van het gehele hart met verschillende enzymmengsel een techniek die hoge opbrengsten van Ca ^{2 +-tolerante} cellen ¹⁴ produceert. Isolatie van cardiale myocyten van fragmenten van weefsel inherent minder succesvol waarschijnlijk vanwege de beperkte toegankelijkheid van enzymen individuele myocyten vergeleken met die bereikt door perfusie van kransslagaders. Vanwege de beperkte beschikbaarheid van ongebruikte donorharten, de enige praktische manier om normale humane ventriculaire cellen te verkrijgen regelmatig is door enzymatische spijn van de vaak zeer kleine weefselfragmenten weggesneden tijdens electieve chirurgische procedures. De enige menselijke ziektemodel die grondig gekarakteriseerd op celniveau terminaal hartfalen, vanwege de toegankelijkheid van getransplanteerde harten. Echter, terminal hartfalen optreedt in een minderheid van de patiënten vaak gaat om een gemeenschappelijke route van ernstige herinrichting van myocardiale cellen, die relatief onafhankelijk van de onderliggende oorzaak ^15. De mogelijkheid om de functie van afzonderlijke hartspiercellen uit beoordelen patiënten eerder niet falende stadium van de ziekte is cruciaal voor de specifieke pathofysiologie van verschillende erfelijke of verworven aandoeningen begrijpen. Hypertrofische cardiomyopathie (HCM) is een sprekend voorbeeld. HCM is een gemeenschappelijke (1/500 personen) erfelijke cardiale aandoening gekenmerkt door hypertrofie van het hart, verhoogde arrhythmogenic risico en contractiele veranderingen als gevolg van obstructie van de uitstroom en diastolische dysfunctie ^16. Hartspiercellen van HCM harten undergo een complexe verbouwing processen die veranderingen in celstructuur (hypertrofie, myofibrillar wanorde) en EG-Koppeling ^17. Echter, de meeste informatie van myocyte disfunctie bij HCM is afkomstig van transgene diermodellen. Aangezien slechts een minderheid van de HCM patiënten evolueert in de richting van terminal hartfalen en vereist harttransplantatie, HCM harten zijn zeer zelden beschikbaar voor celisolatie met standaard methoden. Echter, ten minste 30% van de HCM patiënten ontwikkelen obstructieve symptomen als gevolg van massale septum hypertrofie veranderen uitstroombaan bloedstroom tijdens systole (HCM) ^18. De meest effectieve beschikbare therapeutische optie voor de verlichting van de obstructie in HCM is chirurgische septum myectomy: tijdens deze chirurgische procedure wordt een variabele grootte deel van de bovenste septum verwijderd door trans aorta aanpak. Dit gedeelte van hypertrofe septum is dus beschikbaar voor celisolatie uit de verse weefsel.

Werkwijze voor de isolatie van menselijke ventricular myocytes van enkele, kleine transvenous endomyocardiale biopsiespecimens eerder is ontwikkeld en gepubliceerd ^19. We hebben een methode om enkele septum myocytes isoleren van ventriculaire myocard monsters van patiënten die hartchirurgie ondergaan, waaronder patiënten met HCM ondergaan septum myectomy en patiënten die een klepvervanging procedures. Naast een gedetailleerde beschrijving van de isolatieprotocol representatief elektrofysiologische en ^{Ca2 +} fluorescentiemetingen worden, dat de levensvatbaarheid van de geïsoleerde humane ventriculaire myocyten en de haalbaarheid van patch clamp en intracellulaire ^{Ca2 +} onderzoeken.

Protocol

De experimentele protocollen op menselijk weefsel werden goedgekeurd door de ethische commissie van Careggi Universitair Ziekenhuis (2006/0024713; vernieuwd mei 2009). Elke patiënt gaf schriftelijk toestemming. 1. Solutions en apparatuur voorbereiding Oplossingen worden beschreven in Tabel 1. Een vereenvoudigd stroomschema van de cel isolatieprocedure wordt in Figuur 1. …

Representative Results

De hierboven beschreven werkwijze werd gebruikt om de functionele abnormaliteiten cardiomyocyten geïsoleerd uit het septum patiënten met hypertrofische cardiomyopathie (HCM) die myectomy operatie ondergingen kenmerken, vergeleken met niet niet niet hypertrofische chirurgische patiënten 21. De resultaten in dit deel zijn afgeleid van dat werk 21 en worden hier getoond als een voorbeeld van hoe deze techniek gebruikt kan worden om de veranderingen in myocardiale celfunctie cardiale aandoeningen ka…

Discussion

Wij hebben beschreven en gevalideerde werkwijze levensvatbare myocyten isoleren van chirurgische monsters van menselijk ventriculair myocard. Vanaf eerder beschreven protocollen die met succes had gebruikt om geïsoleerde cellen van atriale chirurgische monsters, de techniek om de scheiding van enkele levensvatbare myocytes van zieke ventriculaire myocard werd ontwikkeld en verfijnd. Vroege rapporten bleek dat isolatie van enkele hartspiercellen uit brokken van atriale en ventriculaire weefsel selectief verminderde repo…

Materials

Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P9791
Magnesium sulfate heptahydrate(MgSO4 * 7H2O)	Sigma-Aldrich	M1880
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Adenosine	Sigma-Aldrich	A9251
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
Mannitol	Sigma-Aldrich	M4125
Taurine	Sigma-Aldrich	T0625
Potassium hydroxide (KOH)	Sigma-Aldrich	P5958
Sodium chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S7653
Potassium chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P9333
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)	Sigma-Aldrich	S7907
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S6297
Potassium bicarbonate (KHCO3)	Sigma-Aldrich	237205
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P2256
2,3-Butanedione monoxime	Sigma-Aldrich	B0753
Sodium hydroxide(NaOH)	Sigma-Aldrich	S8045
L-Glutamic acid monopotassium salt monohydrate	Sigma-Aldrich	49601
Pyruvic acid	Sigma-Aldrich	107360
3-Hydroxybutyric acid	Sigma-Aldrich	166898
Adenosine 5′-triphosphate dipotassium salt dihydrate (K2-ATP)	Sigma-Aldrich	A8937
Creatine	Sigma-Aldrich	C0780
Succinic Acid	Sigma-Aldrich	S3674
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA)	Sigma-Aldrich	E0396
Albumin from bovine serum	Sigma-Aldrich	A0281
Magnesium chloride (MgCl2)	Sigma-Aldrich	M8266
Collagenase from Clostridium histolyticum, Type V	Sigma-Aldrich	C9263
Proteinase, Bacterial, Type XXIV	Sigma-Aldrich	P8038
Calcium chloride solution, ~1 M in H2O	Sigma-Aldrich	21115
Calcium chloride 0.1 M solution	Sigma-Aldrich	53704
Potassium methanesulfonate	Sigma-Aldrich	83000
FluoForte Reagent	Enzo Life Sciences	ENZ-52015
Powerload concentrate, 100X	Life Technologies	P10020
Perfusion Fast-Step System	Warner Instruments	VC-77SP
Amphotericin B solubilized	Sigma-Aldrich	A9528
Multiclamp 700B patch-clamp amplifier	Molecular Devices
Digidata 1440A	Molecular Devices
pClamp10.0	Molecular Devices
Digestion Device	CUSTOM	CUSTOM	The device is custome made in our laboratory using plastic tubes, cast Sylgard and a motor; it is described in detail in Fig 1 C-D and in Fig.7. We can provide further details if requested
Silicone elastomer for the digestion device's brushes	Dow Corning	SYLGARD® 184
Variable speed rotating motor for the digestion device	Crouzet	Crouzet 178-4765
Mold for brushes casting	N.A.	N.A.	The mold is custom made from standard PTFE 2.5 cm diameter rods