離と新鮮な外科的試料からのヒト心室の心筋細胞の機能解析

Summary

心疾患の細胞に基づく現在の知識は、ほとんどの動物モデルの研究に依存しています。ここでは、説明し、人間の心室心筋の小さな外科的サンプルから単実行可能な心筋細胞を得るための新しい方法を検証する。ヒト心室筋細胞は、電気生理学的研究および薬物試験のために使用することができる。

Abstract

疾患のある心臓の心筋細胞は、細胞構造、励起収縮連関および膜イオン電流の変化を伴う複雑なリモデリングプロセスに供される。これらの変更は増加催不整脈リスクと心臓病患者における収縮期および拡張機能障害につながる収縮の変化の原因であると思われる。しかし、心疾患における心筋細胞機能の変化は上のほとんどの情報は、動物モデルから来ている。

ここでは、説明し、心臓手術操作を受けている患者からの心室の心筋の小さな外科的サンプルから実行可能な筋細胞を単離するためのプロトコルを検証する。プロトコルが詳細に記載されている。電気生理学的および細胞内カルシウムの測定は、この方法で得られたヒト心室心筋細胞における単一細胞の測定数の実現可能性を実証することが報告されている。

プロトコルは、彼を報告した再様々な心臓疾患の存在下で、人間の心臓の機能的変化の細胞および分子基盤の将来の調査のために役立ちます。また、この方法は、細胞レベルで新規な治療標的を同定するために、ダイレクト並進値と、ヒト心筋細胞に新規化合物の有効性を試験するために使用することができる。

Introduction

心筋の電気生理学的特性の解剖は、単一の心筋細胞を単離するための技術の開発の後に顕著に進んでいる。心臓の興奮収縮連関（ECカップリング）の理解における最近の進歩はまた、完全な組織の全ての生理学的特性を保持している実行可能な単一の心筋細胞を単離する能力によって可能になってきた。パッチクランプ法は日常的機能および心臓筋細胞膜のイオン電流の薬理学的調節を研究するために使用される。のCa ^{2 +}感受性色素と細胞内カルシウム動態の記録はまた、定期的に、ECカップリングの生理学上だけでなく、細胞内Ca ^{2 +}の病理学的変化に重要なデータを提供し、健康で病気の様々なモデルから単一の心筋細胞上で実行される機械的な障害や心疾患増加催不整脈の負担につながる恒常性。情これらの研究からのTiONは、臨床現場における薬物の電気生理学的および機械的な影響を理解するために重要です。しかし、貫通電流および心臓の活動電位と心臓力学の特定の機能を占め、ECカップリングタンパク質における種特異的な違いがあります。非ヒト哺乳動物から単離した筋細胞の研究は、生物物理学的特性および特定の膜貫通イオンチャネルおよびEC結合タンパク質の生理的役割を解明しつつ、それらは必ずしも人間の心筋細胞の関連のモデルを提供していません。人間の心筋からの実行可能な筋細胞の単離は、完全に心疾患の病態生理を理解し、新たな治療アプローチを検証することが不可欠である。

心耳は、多くの場合、外科的手技中に破棄されたように、ヒト心房組織は、容易に入手可能である。成人の心臓の活動電位とイオンのCuの初期定量的研究rrentsを酵素的に孤立性心房細胞の^1-4を採用。活動電位または単離された成人の心室細胞からの電流の記録は、その後^3,5-10を報告されている。これらの研究のほとんどは、外植された心臓から得られた細胞を使用し、単離された細胞を得るためにコラゲナーゼ冠動脈セグメントまたは切除組織の比較的大量の暴露のコラゲナーゼ灌流のいずれかを利用している。これらの研究は、健康な心からの人間の心室心筋細胞からターミナル心不全患者からの膜貫通イオン電流の数の詳細な特性を可能にした。 L型の録音は、Ca ^{2 +}電流（I _CA-L）を ^5-7、一過性外向きカリウム電流（I） _は ^8は 、整流カリウム内向き電流（私は_^κ1）8、遅延整流カリウム電流のさまざまなコンポーネントは、（私は_κ ^9）が報告されている。の進歩と精製単離手順^10は 、脱分極¹²期および拡張期脱分極および早期のビートにつながる面白い、現在^13に増加した後に遅れて活動電位延長^11を含む、ターミナル心不全で増加催不整脈性のイオン根拠の明確な特性評価を可能にした。

アダルト心筋細胞は通常、様々な酵素混合物で心臓全体のCa ^{2 +}トレラント細胞¹⁴を高収率で生産する技術の逆行性灌流によって小さな動物から単離される。組織の断片からの心筋細胞の単離は、冠状動脈の灌流によって達成されるものと比較しているため、個々の筋細胞への酵素の限られたアクセス、おそらく本質的にあまり成功しています。なぜなら、未使用のドナー心臓の非常に限られた入手可能性、定期的に正常なヒト心室細胞を得るための唯一の実用的な方法は、酵素digestioである待機的外科手術中に切除しばしば非常に小さな組織フラグメントのN。徹底的に細胞レベルで特徴付けられている唯一のヒト疾患モデルでは、移植された心臓へのアクセスのために、端末心不全である。しかし、端末の心不全は、少数の患者が発生し、多くの場合、根本的な原因¹⁵は比較的独立している心筋細胞の深刻な改造の共通の経路を伴う。疾患の初期非失敗の段階で患者からの単一心筋細胞の機能を評価する能力は、異なる遺伝性または後天条件の具体的な病態生理を理解することが重要です。肥大型心筋症（HCM）は語っ例です。 HCMは、流出路閉塞および拡張機能障害¹⁶による催不整脈リスクと収縮の変化を一般的な（1/500個体）心肥大が特徴継承心臓状態、増加している。 HCMの心臓から心筋細胞Uセル構造の変化（肥大、筋原線維混乱）とEC-カップリング^17を含む複雑なリモデリング過程をndergo。しかし、HCMでの筋細胞機能障害のほとんどの情報は、トランスジェニック動物モデルから来ている。 HCM患者のごく少数が端末心不全に向かって進化し、心臓移植を必要とするため、HCMの心は非常にまれに、標準的な方法を用いた細胞単離のために使用できません。しかし、HCM患者の少なくとも30％が、収縮期^（HCM）18中に流出路の血流を変化させる大規模な中隔肥大に起因する閉塞症状を発症する。 HCMにおける障害物の救済のための最も効果的な利用可能な治療の選択肢は、手術中隔の心筋切除術である：この外科手術中、上側の中隔の可変サイズの部分は、トランス大動脈アプローチによって除去される。肥大した中隔のこの部分は、新鮮な組織からの細胞を単離するための、したがって提供されています。

人間ventriculaの単離のための方法Rシングル、小型の経静脈心内膜心筋生検標本からの筋細胞は、以前に開発され^、19を公表されている。私たちは、中隔心筋切除術および弁置換処置を受けた患者を受けHCMの患者を含む心臓手術を、受けている患者からの心室の心筋サンプルから単中隔の筋細胞を単離するための方法を実施しました。単離プロトコールの詳細な説明に加えて、代表的な電気生理学的およびCa ^{2 +}の蛍光測定は、単離されたヒト心室筋細胞の生存率およびパッチクランプ及び細胞内Ca ^{2 +}の研究の実現可能性を実証し、提示される。

Protocol

（; 2009年5月リニューアル2006/0024713）、ヒトの組織についての実験プロトコルがCareggi大学病院の倫理委員会によって承認された。各患者は、書面によるインフォームドコンセントを与えた。 1。ソリューションと設備の準備溶液は、表1に記載されている。細胞単離手順の簡略化したフローチャートを図1に見出される。 <tabl…

Representative Results

非障害の非肥大手術患者21と比較して、上述の方法は、心筋切除術の手術を受けた肥大型心筋症（HCM）を有する患者の心室中隔から単離された心筋細胞の機能異常を特徴づけるために用いた。このセクションに含まれている結果は、ワーク21から誘導され、この技術は、心臓の疾患状態における心筋細胞機能の変化を特徴付けるために使用することができる方法の例として示?…

Discussion

私たちは、説明され、人間の心室の心筋の外科サンプルから実行可能な筋細胞を単離するための方法を検証しています。首尾よく心房外科試料から単離した細胞に使用されていた以前に記載されたプロトコルから始めて、病気の心室の心筋から単一の実行可能な筋細胞の分離を可能にする技術が開発され、微調整した。初期の報告では、冠灌流を介してバッファを含む酵素の配信が遅延整流?…

Materials

Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P9791
Magnesium sulfate heptahydrate(MgSO4 * 7H2O)	Sigma-Aldrich	M1880
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Adenosine	Sigma-Aldrich	A9251
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
Mannitol	Sigma-Aldrich	M4125
Taurine	Sigma-Aldrich	T0625
Potassium hydroxide (KOH)	Sigma-Aldrich	P5958
Sodium chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S7653
Potassium chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P9333
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)	Sigma-Aldrich	S7907
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S6297
Potassium bicarbonate (KHCO3)	Sigma-Aldrich	237205
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P2256
2,3-Butanedione monoxime	Sigma-Aldrich	B0753
Sodium hydroxide(NaOH)	Sigma-Aldrich	S8045
L-Glutamic acid monopotassium salt monohydrate	Sigma-Aldrich	49601
Pyruvic acid	Sigma-Aldrich	107360
3-Hydroxybutyric acid	Sigma-Aldrich	166898
Adenosine 5′-triphosphate dipotassium salt dihydrate (K2-ATP)	Sigma-Aldrich	A8937
Creatine	Sigma-Aldrich	C0780
Succinic Acid	Sigma-Aldrich	S3674
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA)	Sigma-Aldrich	E0396
Albumin from bovine serum	Sigma-Aldrich	A0281
Magnesium chloride (MgCl2)	Sigma-Aldrich	M8266
Collagenase from Clostridium histolyticum, Type V	Sigma-Aldrich	C9263
Proteinase, Bacterial, Type XXIV	Sigma-Aldrich	P8038
Calcium chloride solution, ~1 M in H2O	Sigma-Aldrich	21115
Calcium chloride 0.1 M solution	Sigma-Aldrich	53704
Potassium methanesulfonate	Sigma-Aldrich	83000
FluoForte Reagent	Enzo Life Sciences	ENZ-52015
Powerload concentrate, 100X	Life Technologies	P10020
Perfusion Fast-Step System	Warner Instruments	VC-77SP
Amphotericin B solubilized	Sigma-Aldrich	A9528
Multiclamp 700B patch-clamp amplifier	Molecular Devices
Digidata 1440A	Molecular Devices
pClamp10.0	Molecular Devices
Digestion Device	CUSTOM	CUSTOM	The device is custome made in our laboratory using plastic tubes, cast Sylgard and a motor; it is described in detail in Fig 1 C-D and in Fig.7. We can provide further details if requested
Silicone elastomer for the digestion device's brushes	Dow Corning	SYLGARD® 184
Variable speed rotating motor for the digestion device	Crouzet	Crouzet 178-4765
Mold for brushes casting	N.A.	N.A.	The mold is custom made from standard PTFE 2.5 cm diameter rods