Dissektion af<em> Xenopus laevis</em> Neural Crest<em> In vitro</em> Eksplantat kultur eller<em> In vivo</em> Transplantation

Summary

Denne protokol beskriver, hvordan man dissekere premigratory kraniel neuralkam (NC) fra Xenopus laevis neurulas. Disse eksplantater kan udpladet på fibronectin og dyrket in vitro, eller podes tilbage i værten embryoner. Denne teknik gør det muligt at studere de mekanismer NC epitel-til-mesenchyme overgang, migration og differentiering.

Abstract

De neurale våbenskjold (NC) er en forbigående dorsal neuralrøret cellepopulation, som gennemgår et epithel-til-mesenchyme overgang (EMT) i slutningen af ​​neurulation, vandrer udstrakt i retning af forskellige organer, og skelner i mange typer af derivater (neuroner, glia, brusk og knogler, pigmenterede og endokrine celler). I denne protokol, beskriver vi, hvordan at dissekere premigratory kranie NC fra Xenopus laevis embryoner, for at studere NC udvikling in vivo og in vitro. Frøen model giver mange fordele til at studere tidlige udvikling, rigelige portioner er tilgængelige, embryoner udvikler sig hurtigt, in vivo gevinst og tab af funktion strategier giver manipulation af genekspression før NC dissektion i donor-og / eller værten embryoner. NC eksplantaterne kan være belagt på fibronektin og anvendes til in vitro-undersøgelser. De kan dyrkes i adskillige dage i et serum-frit defineret medium. Vi beskriver også hvordan man pode NC eksplanteret tilbagei host embryoner til at studere NC migration og differentiering in vivo.

Introduction

De neurale våbenskjold (NC) er en forbigående embryonale celle befolkning, der kommer fra neuralrøret i slutningen af ​​neurulation i hvirveldyr embryoner. Signal-og genetiske begivenheder, der styrer NC specifikation starte så tidligt som gastrulation. NC er angivet på grænsen mellem det neurale og ikke-neurale ectoderm af signaler fra de omkringliggende dorsale væv. Ved udgangen af ​​neurulation NC celler gennemgår en epitel-til-mesenchyme overgang (EMT), og i vidt omfang migrere i embryoet efter stereotype ruter ved at svare på omgivende vejledende signaler. Når de har nået deres endelige bestemmelsessted, de differentierer til en bred vifte af derivater fx neuroner, glia, knogler, brusk og pigmenterede celler ^1-5. På grund af deres bidrag til mange celletyper og væv fra fostre, fejl på ethvert trin af NC-celler udvikling, fra induktion til den endelige differentiering, kan forårsage medfødte syndromer navngivne neurocristopathies ^6. Experimental manipulation af udviklingen NC på forskellige stadier – Specifikation, EMT, migration og differentiering – vil forbedre vores forståelse af neurocristopathies og tillade design af potentielle terapeutiske strategier.

Xenopus laevis embryo er en model af valg for at studere NC udvikling. Et stort antal embryoner er nemme at få, og ekstern befrugtning giver adgang til de allerførste skridt i udviklingen. Mange værktøjer er tilgængelige for eksperimentelt manipulere X. laevis fosterudviklingen. Gene gain-of-funktion og knockdown er nemme at udføre ved mikroinjektion individuelle celler af tidlig blastulas. Embryonale væv kan skæres til in vitro reassociation ^7-11 eller back-podning assays ^12,13.

I denne protokol, beskriver vi, hvordan at dissekere ud premigratory kranie NC i X. laevis sene neurulas forud for migration. Disse eksplantater kan dyrkes på fibronectin-Coated plader at studere migration og differentiering i kontrolleret in vitro eksperimentelle betingelser. NC explanter kan også blive podet ind i normale eller manipulerede værten embryoner til at studere deres migrering og differentiering in vivo.

Protocol

Eksperimenter overholder nationale og europæiske bestemmelser om beskyttelse af dyr, der anvendes til videnskabelige formål, og med internationalt vedtagne principper om erstatning, begrænsning og forfinelse. 1.. Fremstilling af fibronectincoatede Dishes 14 Afpipetteres 500 ml 10 mg / ml kultur klasse fibronectin fortyndet i 1x phosphatpufret saltvand (PBS) i et standard plast petriskålen (Ø 40 x 11 mm). Der inkuberes ved 37 ° C i 1 time. Bemærk: Hvis du bruger g…

Representative Results

Når belagt på fibronektin, de neurale crest eksplantaterne vedhæfte hurtigt (15-30 min) og eksplantatet spreder flad inden 2 timer (Figur 1A). Efter 3-6 timers celler begynder at sprede. Ved 24 timer ved 15 ° C, har mange celler er begyndt at vandre væk fra eksplantatet (Fig. 1B og 1C). Æggeblomme gør cellerne meget lyse under fasekontrast (figur 1B). Cell fremspring (filopodes og lamellipodes) er tydeligt synlige efter phalloidin farvning af akt…

Discussion

Denne protokol beskriver en nem teknik eksplanteres premigratory kraniel NC i X. laevis embryoner. De embryoner, der anvendes til sådanne forsøg skal være robust og helbrede godt. Kassér parti af usunde embryoner. Desuden vokser embryoner ved forskellige temperaturer (fra 12 til 18-20 ° C), med henblik på at udskære neuralkam på 17. etape og ikke senere. Efter trin 17 kan neuralkam blandes med cephalic mesoderm og kan ikke fjernes helt. Xenopus væv heler hurtigt og miste deres adhæsion til an…

Materials

Fibronectin from bovine plasma	Sigma	F4759-1MG
Bovine Serum Albumine. Fraction V	Euromedex	04-100-811-C	Lower quality grade may  be suitable for this application
Stainless Steel Insect Pins. Size 000	FST	26001
Dumont #5 forceps 0.05 mm x 0.02 mm	FST	11252-20