JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

تشريح<em> القيطم المورق</em> العصبية كريست ل<em> في المختبر</em> يزدرع الثقافة أو<em> في الجسم الحي</em> زرع

Published: March 04, 2014
doi:
10.3791/51118
,
1Institut Curie,Centre Universitaire, 2Université Paris Sud,Centre Universitaire, 3CNRS UMR 3347,Centre Universitaire, 4INSERM U1021,Centre Universitaire

Summary

يصف هذا البروتوكول كيفية تشريح premigratory قمة العصبية القحفية (NC) من القيطم neurulas المورق. هذه إإكسبلنتس يمكن مطلي على فبرونيكتين وتربيتها في المختبر، أو المطعمة مرة أخرى إلى الأجنة المضيفة. هذه التقنية تسمح بدراسة آليات NC ظهارة إلى اللحمة المتوسطة التي تمر بمرحلة انتقالية، والهجرة، والتمايز.

Abstract

قمة العصبية (NC) هو السكان الخلية الظهرية الأنبوب العصبي عابرة أن يخضع لظهارة الانتقالية إلى اللحمة المتوسطة (EMT) في نهاية تكون العصيبة، على نطاق واسع يهاجر نحو مختلف الأجهزة، ويميز في العديد من أنواع المشتقات (الخلايا العصبية، الدبقية، الغضاريف والعظام، والخلايا الصباغية والغدد الصماء). في هذا البروتوكول، ونحن تصف كيفية تشريح الجمجمة NC premigratory من الأجنة القيطم المورق، من أجل دراسة تطوير NC في الجسم الحي في المختبر. نموذج الضفدع توفر العديد من المزايا لدراسة التطور المبكر؛ هي دفعات وفيرة والأجنة تتطور بسرعة، في الجسم الحي الربح والخسارة من وظيفة تسمح استراتيجيات التلاعب في التعبير الجيني قبل NC في تشريح المانحة و / أو الأجنة المضيفة. لل explants NC يمكن مطلي على فبرونيكتين وتستخدم لفي الدراسات المختبرية. أنها يمكن تربيتها لعدة أيام في وسط المصل خالية محددة. نحن أيضا تصف كيفية الكسب غير المشروع إإكسبلنتس NC العودةفي الأجنة المضيفة لدراسة الهجرة NC والتمايز في الجسم الحي.

Introduction

قمة العصبية (NC) هي الخلايا الجنينية عابرة السكان أن يخرج من الأنبوب العصبي في نهاية تكون العصيبة في أجنة الفقاريات. الأحداث إشارات والوراثية التي تتحكم في مواصفات NC تبدأ في وقت مبكر تكون المعيدة. يتم تحديد NC على الحدود بين العصبية والأديم الظاهر غير العصبية التي كتبها إشارات من الأنسجة المحيطة الظهرية. في نهاية تكون العصيبة، والخلايا NC الخضوع لظهارة الانتقال إلى اللحمة المتوسطة (EMT) والهجرة على نطاق واسع في الجنين التالية الطرق النمطية من خلال الاستجابة لتوجيه العظة المحيطة. بمجرد أن وصلت إلى وجهتها النهائية، فإنها تفرق في مجموعة واسعة من المشتقات، مثل الخلايا العصبية، الدبقية والعظام والغضاريف، والخلايا الصباغية 1-5. بسبب مساهمتها في العديد من أنواع الخلايا والأنسجة الجنينية، والعيوب في أي خطوة من تطوير خلايا NC، من الحث على التمايز النهائي، يمكن أن يسبب أعراض الخلقية اسمه neurocristopathies 6. Eالتلاعب xperimental من NC النامية في مراحل مختلفة – مواصفات، EMT، والهجرة، والتمايز – من شأنها تحسين فهمنا للneurocristopathies والسماح تصميم الاستراتيجيات العلاجية المحتملة.

والمورق القيطم الجنين هو نموذج من خيار لدراسة تطوير NC. أعداد كبيرة من الأجنة من السهل الحصول عليها، والإخصاب الخارجي يتيح الوصول إلى الخطوات الأولى من التنمية. العديد من الأدوات المتاحة لمعالجة تجريبيا اكس. المورق التطور الجنيني. مكسب من وظيفة وضربة قاضية الجينات هي سهلة لأداء microinjecting بواسطة الخلايا الفردية من blastulas في وقت مبكر. ويمكن خفض الأنسجة الجنينية في المختبر لإعادة الترابط 7-11 أو ترقيع العودة المقايسات 12،13.

في هذا البروتوكول، ونحن تصف كيفية تشريح خارج premigratory NC في الجمجمة X. المورق neurulas في وقت متأخر، قبل الهجرة. يمكن تربيتها هذه إإكسبلنتس على فبرونيكتين-coateلوحات د لدراسة الهجرة وتمايز في التحكم في ظروف تجريبية المختبر. ويمكن أيضا أن المطعمة إإكسبلنتس NC في الأجنة المضيفة العادي أو التلاعب بها لدراسة هجرتها والتمايز في الجسم الحي.

Protocol

تجارب الامتثال التنظيم الوطنية والأوروبية لحماية الحيوانات المستخدمة لأغراض علمية ومع المبادئ المعمول بها دوليا من استبدال، والحد من والصقل. 1. إعداد أطباق فبرونيكتين المغلفة-14 <li style=";text-align:right;direc…

Representative Results

عندما مطلي على فبرونيكتين، لل explants قمة العصبية إرفاق بسرعة (15-30 دقيقة) وازدراع ينتشر داخل شقة 2 ساعة (الشكل 1A). بعد 3-6 ساعة تبدأ في الخلايا مبعثر. في 24 ساعة عند 15 درجة مئوية، وقد بدأت العديد من الخلايا لتهاجر بعيدا عن ازدراع (الأرقام 1B و 1C). صفار …

Discussion

يصف هذا البروتوكول تقنية سهلة لازدراع premigratory الجمجمة NC في اكس الأجنة المورق. الأجنة المستخدمة في مثل هذه التجارب تحتاج إلى أن تكون قوية وتلتئم بشكل جيد. تجاهل أي دفعة من الأجنة غير صحية. بالإضافة إلى ذلك، تنمو الأجنة في درجات حرارة مختلفة (من 12 إلى 18-20 درجة مئ…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

المؤلفين أشكر أدلين دوللي للصور من يزدرع على فبرونيكتين، اريك Theveneau لإجراء مناقشات مفيدة ومرفق الحيوان من معهد كوري. CM هو زميل ما بعد الدكتوراه لمنطقة إيل دي فرانس (دومين من أجل المصلحة فيل الجذعية القطب)، جامعة باري سود (الملحق Temporaire كوت ENSEIGNEMENT آخرون للبحوث)، والوكالة الوطنية للبحوث لا. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل جامعة باري سود (Attractivite 2011)، والمركز الوطني للبحوث العلميه (برنامج العمل Thematique آخرون Incitative سور)، والرابطة من أجل لا مناهضة بحوث السرطان جنيه منحة SFI20101201882، الدوري الفرنسي الدرجة مناهضة جنيه للسرطان، والوكالة الوطنية دي لا بحوث (الوكالة الوطنية للبحوث برنامج لا بلان).

Materials

Fibronectin from bovine plasma Sigma F4759-1MG
Bovine Serum Albumine. Fraction V Euromedex 04-100-811-C Lower quality grade may  be suitable for this application
Stainless Steel Insect Pins. Size 000 FST 26001
Dumont #5 forceps 0.05 mm x 0.02 mm FST 11252-20
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sauka-Spengler, T., Bronner-Fraser, M. A gene regulatory network orchestrates neural crest formation. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (7), 557-568 (2008).
  2. Theveneau, E., Mayor, R. Neural crest delamination and migration: from epithelium-to-mesenchyme transition to collective cell migration. Dev. Biol. 366 (1), 34-54 (2012).
  3. Stuhlmiller, T. J., García-Castro, M. I. Current perspectives of the signaling pathways directing neural crest induction. Cell. Mol. Life Sci. 69 (22), 3715-3737 (2012).
  4. Milet, C., Monsoro-Burq, A. H. Neural crest induction at the neural plate border in vertebrates. Dev. Biol. 366 (1), 22-33 (2012).
  5. Pegoraro, C., Monsoro-Burq, A. H. Signaling and transcriptional regulation in neural crest specification and migration: lessons from Xenopus embryos. Dev. Biol. 2 (2), 247-259 (2013).
  6. Etchevers, H. C., Amiel, J., Lyonnet, S. Molecular Bases of Human Neurocristopathies. Neural Crest Induct. Different. 589, 213-234 (2005).
  7. Nieuwkoop, P. D., et al. Activation and organization of the central nervous system in amphibians. Part II. Differentiation and organization. J. Exp. Zool. 120 (1), 33-81 (1952).
  8. Nieuwkoop, P. D., et al. Activation and organization of the central nervous system in amphibians Part I. Induction and activation. J. Exp. Zool. 120 (1), 1-31 (1952).
  9. Sharpe, C. R., Fritz, A., De Robertis, E. M., Gurdon, J. B. A homeobox-containing marker of posterior neural differentiation shows the importance of predetermination in neural induction. Cell. 50 (5), 749-758 (1987).
  10. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. . Early development of Xenopus laevis: a laboratory manual. , (2000).
  11. Monsoro-Burq, A. -. H., Fletcher, R. B., Harland, R. M. Neural crest induction by paraxial mesoderm in Xenopus embryos requires FGF signals. Development. 130 (14), 3111-3124 (2003).
  12. Milet, C., Maczkowiak, F., Roche, D. D., Monsoro-Burq, A. H. Pax3 and Zic1 drive induction and differentiation of multipotent, migratory, and functional neural crest in Xenopus embryos. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (14), 5528-5533 (2013).
  13. Sadaghiani, B., Thiébaud, C. H. Neural crest development in the Xenopus laevis embryo, studied by interspecific transplantation and scanning electron microscopy. Dev. Biol. 124 (1), 91-110 (1987).
  14. Theveneau, E., et al. Collective chemotaxis requires contact-dependent cell polarity. Dev. Cell. 19 (1), 39-53 (2010).
  15. Slack, J. M., Forman, D. An interaction between dorsal and ventral regions of the marginal zone in early amphibian embryos. J. Embryol. Exp. Morphol. 56, 283-299 (1980).
  16. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Embryo dissection and micromanipulation tools. CSH Protoc. , (2007).
  17. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal table of Xenopus laevis (Daudin): a systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , (1994).
  18. Theveneau, E., Mayor, R. Beads on the run: beads as alternative tools for chemotaxis assays. Methods Mol. Biol. 769, 449-460 (2011).
  19. Bronner, M. E., LeDouarin, N. M. Development and evolution of the neural crest: An overview. Dev. Biol. 366 (1), 2-9 (2012).
  20. Alfandari, D., Cousin, H., Gaultier, A., Hoffstrom, B. G., DeSimone, D. W. Integrin α5β1 supports the migration of Xenopus cranial neural crest on fibronectin. Dev. Biol. 260 (2), 449-464 (2003).
  21. Fort, P., et al. Activity of the RhoU/Wrch1 GTPase is critical for cranial neural crest cell migration. Dev. Biol. 350 (2), 451-463 (2011).
  22. Matthews, H. K., et al. Directional migration of neural crest cells in vivo is regulated by Syndecan-4/Rac1 and non-canonical Wnt signaling/RhoA. Development. 135 (10), 1771-1780 (2008).
  23. Kashef, J., Köhler, A., Kuriyama, S., Alfandari, D., Mayor, R., Wedlich, D. Cadherin-11 regulates protrusive activity in Xenopus cranial neural crest cells upstream of Trio and the small GTPases. Genes Dev. 23 (12), 1393-1398 (2009).
  24. Hwang, Y. -. S., Luo, T., Xu, Y., Sargent, T. D. Myosin-X is required for cranial neural crest cell migration in Xenopus laevis. Dev. Dyn. 238 (10), 2522-2529 (2009).
  25. Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461 (7262), 402-406 (2009).
  26. Mica, Y., Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. Modeling Neural Crest Induction, Melanocyte Specification, and Disease-Related Pigmentation Defects in hESCs and Patient-Specific iPSCs.. Cell Reports. 3 (4), 1140-1152 (2013).
  27. Shnitsar, I., Borchers, A. PTK7 recruits dsh to regulate neural crest migration. Development. 135 (24), 4015-4024 (2008).
  28. Matthews, H. K., et al. Directional migration of neural crest cells in vivo is regulated by Syndecan-4/Rac1 and non-canonical Wnt signaling/RhoA. Development. 135 (10), 1771-1780 (2008).
  29. Matthews, H. K., Broders-Bondon, F., Thiery, J. P., Mayor, R. Wnt11r is required for cranial neural crest migration. Dev. Dyn. 237 (11), 3404-3409 (2008).
  30. Carmona-Fontaine, C., et al. Contact inhibition of locomotion in vivo controls neural crest directional migration. Nature. 456 (7224), 957-961 (2008).
  31. Guiral, E. C., Faas, L., Pownall, M. E. Neural crest migration requires the activity of the extracellular sulphatases XtSulf1 and XtSulf2. Dev. Biol. 341 (2), 375-388 (2010).
  32. Cousin, H., Abbruzzese, G., Kerdavid, E., Gaultier, A., Alfandari, D. Translocation of the Cytoplasmic Domain of ADAM13 to the Nucleus Is Essential for Calpain8-a Expression and Cranial Neural Crest Cell Migration. Dev. Cell. 20 (2), 256-263 (2011).
  33. Borchers, A., David, R., Wedlich, D. Xenopus cadherin-11 restrains cranial neural crest migration and influences neural crest specification. Development. 128 (16), 3049-3060 (2001).
  34. Borchers, A., Epperlein, H. -. H., Wedlich, D. An assay system to study migratory behavior of cranial neural crest cells in Xenopus. Dev. Genes Evol. 210 (4), 217-222 (2000).
  35. Kerney, R., Gross, J. B., Hanken, J. Runx2 is essential for larval hyobranchial cartilage formation in Xenopus laevis. Dev. Dyn. 236 (6), 1650-1662 (2007).
  36. Yan, C. Y. I., Skourides, P., Chang, C., Samba Brivanlou, A. a Xenopus hnRNP expressed in neural and neural crest tissues. Dev. Dyn. 238 (1), 204-209 (2009).
  37. Acloque, H., Adams, M. S., Fishwick, K., Bronner-Fraser, M., Nieto, M. A. Epithelial-mesenchymal transitions: the importance of changing cell state in development and disease. J. Clin. Invest. 119 (6), 1438-1449 (2009).

Tags

Neural CrestXenopus LaevisDissectionExplant CultureIn Vivo TransplantationEpithelium-to-mesenchyme TransitionMigrationDifferentiation
check_url/51118?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Milet, C., Monsoro-Burq, A. H. Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation. J. Vis. Exp. (85), e51118, doi:10.3791/51118 (2014).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image