Dissection של<em> Laevis Xenopus</em> העצבי קרסט עבור<em> במבחנה</em> Explant תרבות או<em> In vivo</em> השתלות
Summary
פרוטוקול זה מתאר כיצד לנתח פסגת premigratory גולגולת עצבית (NC) מneurulas laevis Xenopus. יכול להיות מצופה explants אלה בפיברונקטין ותרבית במבחנה, או מורכב בחזרה לעוברי מארח. טכניקה זו מאפשרת חקר המנגנונים של מעבר NC האפיתל לmesenchyme, הגירה, ובידול.
Abstract
הרכס העצבי (NC) הוא אוכלוסיית תאים בצינור עצבי הגבי חולפת שעוברת מעבר אפיתל לmesenchyme (EMT) בסוף neurulation, נודד בהרחבה לאיברים שונים, ומבדיל בסוגים רבים של מכשירים נגזרים (נוירונים, גליה, סחוס ועצם, תאי פיגמנט ומערכת האנדוקרינית). בפרוטוקול זה, אנו מתארים כיצד לנתח את NC גולגולת premigratory מעוברי Xenopus laevis, במטרה ללמוד פיתוח NC in vivo ו במבחנה. מודל הצפרדע מציע יתרונות רבים ללמוד פיתוח מוקדם; קבוצות בשפע זמינות, עובר לפתח במהירות, in vivo רווח והפסד של אסטרטגיות פונקציה לאפשר מניפולציה של ביטוי גנים לפני לנתיחה NC בתורם ו / או עוברי מארח. יכול להיות מצופה explants NC בפיברונקטין ומשמש למחקרים במבחנה. הם יכולים להיות מתורבת במשך כמה ימים במדיום מוגדר חופשי בסרום. אנו גם מתארים כיצד להרכיב explants NC בחזרהלעוברי מארח לחקר נדידת NC ובידול in vivo.
Introduction
הרכס העצבי (NC) הוא אוכלוסיית תאים עוברית חולפת העולה מהצינור העצבי בסוף neurulation בעוברי החולייתנים. אירועי האיתות וגנטיים המפקחים על מפרט NC להתחיל מוקדם ככל gastrulation. NC זו שצוין בגבול בין עצבי והאאקטודרם אינו עצבי על ידי אותות מרקמות גב שמסביב. בסופו של neurulation, תאי NC לעבור מעבר אפיתל לmesenchyme (EMT) ולהעביר בהרחבה בעובר בעקבות מסלולים סטריאוטיפיים על ידי היענות לרמזים המקיפים מנחים. ברגע שהם הגיעו ליעד הסופי שלהם, הם להתמיין למגוון רחב של מכשירים פיננסיים נגזרים, למשל תאי עצב, גליה, עצם, סחוס, ותאי פיגמנט 1-5. בגלל תרומתם לסוגי תאים רבים וברקמות עובריים, פגמים בכל שלב בהתפתחות תאי NC, מאינדוקציה להתמיינות סופית, יכול לגרום לתסמונות מולדים בשם neurocristopathies 6. Eהמניפולציה xperimental של NC הפיתוח בשלבים שונים – מפרט, EMT, הגירה, ובידול – תשפר את ההבנה של neurocristopathies ולאפשר עיצוב של אסטרטגיות טיפוליות פוטנציאליות.
עובר laevis Xenopus הוא מודל של בחירה ללמוד פיתוח צפון קרוליינה. מספר גדול של עוברים הם קלים להשגה, והפריה חיצונית נותנת גישה לשלבים הראשונים של פיתוח. כלים רבים זמינים כדי לתפעל באופן ניסיוני X. laevis התפתחות עוברית. גן רווח של פונקציה ומציאה קל לביצוע על ידי microinjecting תאים בודדים של blastulas המוקדם. רקמות עוברי ניתן לחתוך לאיחוד מחדש במבחנה 7-11 או מבחני גב השתלת 12,13.
בפרוטוקול זה, אנו מתארים כיצד לנתח את NC גולגולת premigratory בX. laevis מאוחר neurulas, לפני ההגירה. יכול להיות מתורבת explants אלה על פיברונקטין-coateצלחות ד ללמוד הגירה והבחנה שבשליטה בתנאי ניסוי מבחנה. יכול גם להיות מורכב explants NC לעוברי מארח נורמלים או מניפולציה כדי ללמוד ההגירה והבידול שלהם in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מתאר טכניקה קלה explant NC גולגולת premigratory בעוברי laevis X.. העוברים המשמשים לניסויים כאלה צריכים להיות חזקים ולרפא היטב. לבטל את כל אצווה של עוברים בריאים. בנוסף, לגדול עוברים בטמפרטורות שונות (מ -12 ל 18-20 ° C), על מנת לכרות רכס עצבי בשלב 17 ולא מאוחר יותר. לאחר שלב 1…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים אדלין דולי לתמונות של explant על פיברונקטין, אריק Theveneau לדיונים מועילים ומתקן בעלי החיים של מכון קירי. CM הוא בחור דוקטורט של אזור איל דה פראנס (Domaine d'interet Majeur גזע פולני), אוניברסיטת פריז Sud (נספח ד 'הזמנית של Enseignement et de משוכלל ונדיר), וסוכנות ידיעות Nationale de la משוכלל ונדיר. עבודה זו מומנה על ידי האוניברסיטה לפריז Sud (Attractivite 2011), המרכז הלאומי de la משוכלל ונדיר Scientifique (תכנית הפעולה Thematique et sur Incitative), איגוד לשפוך la משוכלל ונדיר contre le הסרטן גרנט SFI20101201882, Ligue contre le הסרטן, וסוכנות הידיעות Nationale de la משוכלל ונדיר (סוכנות הידיעות Nationale de la משוכלל ונדיר התכנית בלאן).
Materials
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma | F4759-1MG | |
| Bovine Serum Albumine. Fraction V | Euromedex | 04-100-811-C | Lower quality grade may be suitable for this application |
| Stainless Steel Insect Pins. Size 000 | FST | 26001 | |
| Dumont #5 forceps 0.05 mm x 0.02 mm | FST | 11252-20 |
References
- Sauka-Spengler, T., Bronner-Fraser, M. A gene regulatory network orchestrates neural crest formation. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (7), 557-568 (2008).
- Theveneau, E., Mayor, R. Neural crest delamination and migration: from epithelium-to-mesenchyme transition to collective cell migration. Dev. Biol. 366 (1), 34-54 (2012).
- Stuhlmiller, T. J., García-Castro, M. I. Current perspectives of the signaling pathways directing neural crest induction. Cell. Mol. Life Sci. 69 (22), 3715-3737 (2012).
- Milet, C., Monsoro-Burq, A. H. Neural crest induction at the neural plate border in vertebrates. Dev. Biol. 366 (1), 22-33 (2012).
- Pegoraro, C., Monsoro-Burq, A. H. Signaling and transcriptional regulation in neural crest specification and migration: lessons from Xenopus embryos. Dev. Biol. 2 (2), 247-259 (2013).
- Etchevers, H. C., Amiel, J., Lyonnet, S. Molecular Bases of Human Neurocristopathies. Neural Crest Induct. Different. 589, 213-234 (2005).
- Nieuwkoop, P. D., et al. Activation and organization of the central nervous system in amphibians. Part II. Differentiation and organization. J. Exp. Zool. 120 (1), 33-81 (1952).
- Nieuwkoop, P. D., et al. Activation and organization of the central nervous system in amphibians Part I. Induction and activation. J. Exp. Zool. 120 (1), 1-31 (1952).
- Sharpe, C. R., Fritz, A., De Robertis, E. M., Gurdon, J. B. A homeobox-containing marker of posterior neural differentiation shows the importance of predetermination in neural induction. Cell. 50 (5), 749-758 (1987).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. . Early development of Xenopus laevis: a laboratory manual. , (2000).
- Monsoro-Burq, A. -. H., Fletcher, R. B., Harland, R. M. Neural crest induction by paraxial mesoderm in Xenopus embryos requires FGF signals. Development. 130 (14), 3111-3124 (2003).
- Milet, C., Maczkowiak, F., Roche, D. D., Monsoro-Burq, A. H. Pax3 and Zic1 drive induction and differentiation of multipotent, migratory, and functional neural crest in Xenopus embryos. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (14), 5528-5533 (2013).
- Sadaghiani, B., Thiébaud, C. H. Neural crest development in the Xenopus laevis embryo, studied by interspecific transplantation and scanning electron microscopy. Dev. Biol. 124 (1), 91-110 (1987).
- Theveneau, E., et al. Collective chemotaxis requires contact-dependent cell polarity. Dev. Cell. 19 (1), 39-53 (2010).
- Slack, J. M., Forman, D. An interaction between dorsal and ventral regions of the marginal zone in early amphibian embryos. J. Embryol. Exp. Morphol. 56, 283-299 (1980).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Embryo dissection and micromanipulation tools. CSH Protoc. , (2007).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal table of Xenopus laevis (Daudin): a systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , (1994).
- Theveneau, E., Mayor, R. Beads on the run: beads as alternative tools for chemotaxis assays. Methods Mol. Biol. 769, 449-460 (2011).
- Bronner, M. E., LeDouarin, N. M. Development and evolution of the neural crest: An overview. Dev. Biol. 366 (1), 2-9 (2012).
- Alfandari, D., Cousin, H., Gaultier, A., Hoffstrom, B. G., DeSimone, D. W. Integrin α5β1 supports the migration of Xenopus cranial neural crest on fibronectin. Dev. Biol. 260 (2), 449-464 (2003).
- Fort, P., et al. Activity of the RhoU/Wrch1 GTPase is critical for cranial neural crest cell migration. Dev. Biol. 350 (2), 451-463 (2011).
- Matthews, H. K., et al. Directional migration of neural crest cells in vivo is regulated by Syndecan-4/Rac1 and non-canonical Wnt signaling/RhoA. Development. 135 (10), 1771-1780 (2008).
- Kashef, J., Köhler, A., Kuriyama, S., Alfandari, D., Mayor, R., Wedlich, D. Cadherin-11 regulates protrusive activity in Xenopus cranial neural crest cells upstream of Trio and the small GTPases. Genes Dev. 23 (12), 1393-1398 (2009).
- Hwang, Y. -. S., Luo, T., Xu, Y., Sargent, T. D. Myosin-X is required for cranial neural crest cell migration in Xenopus laevis. Dev. Dyn. 238 (10), 2522-2529 (2009).
- Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461 (7262), 402-406 (2009).
- Mica, Y., Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. Modeling Neural Crest Induction, Melanocyte Specification, and Disease-Related Pigmentation Defects in hESCs and Patient-Specific iPSCs.. Cell Reports. 3 (4), 1140-1152 (2013).
- Shnitsar, I., Borchers, A. PTK7 recruits dsh to regulate neural crest migration. Development. 135 (24), 4015-4024 (2008).
- Matthews, H. K., et al. Directional migration of neural crest cells in vivo is regulated by Syndecan-4/Rac1 and non-canonical Wnt signaling/RhoA. Development. 135 (10), 1771-1780 (2008).
- Matthews, H. K., Broders-Bondon, F., Thiery, J. P., Mayor, R. Wnt11r is required for cranial neural crest migration. Dev. Dyn. 237 (11), 3404-3409 (2008).
- Carmona-Fontaine, C., et al. Contact inhibition of locomotion in vivo controls neural crest directional migration. Nature. 456 (7224), 957-961 (2008).
- Guiral, E. C., Faas, L., Pownall, M. E. Neural crest migration requires the activity of the extracellular sulphatases XtSulf1 and XtSulf2. Dev. Biol. 341 (2), 375-388 (2010).
- Cousin, H., Abbruzzese, G., Kerdavid, E., Gaultier, A., Alfandari, D. Translocation of the Cytoplasmic Domain of ADAM13 to the Nucleus Is Essential for Calpain8-a Expression and Cranial Neural Crest Cell Migration. Dev. Cell. 20 (2), 256-263 (2011).
- Borchers, A., David, R., Wedlich, D. Xenopus cadherin-11 restrains cranial neural crest migration and influences neural crest specification. Development. 128 (16), 3049-3060 (2001).
- Borchers, A., Epperlein, H. -. H., Wedlich, D. An assay system to study migratory behavior of cranial neural crest cells in Xenopus. Dev. Genes Evol. 210 (4), 217-222 (2000).
- Kerney, R., Gross, J. B., Hanken, J. Runx2 is essential for larval hyobranchial cartilage formation in Xenopus laevis. Dev. Dyn. 236 (6), 1650-1662 (2007).
- Yan, C. Y. I., Skourides, P., Chang, C., Samba Brivanlou, A. a Xenopus hnRNP expressed in neural and neural crest tissues. Dev. Dyn. 238 (1), 204-209 (2009).
- Acloque, H., Adams, M. S., Fishwick, K., Bronner-Fraser, M., Nieto, M. A. Epithelial-mesenchymal transitions: the importance of changing cell state in development and disease. J. Clin. Invest. 119 (6), 1438-1449 (2009).
