の解剖<em>アフリカツメガエル</em>神経堤のため<em> in vitroで</em>外植片培養又は<em> in vivoで</em>移植
Summary
このプロトコルは、 アフリカツメガエルの neurulasからpremigratory頭蓋神経堤（NC）を分析する方法について説明します。これらの外植片をin vitroで培養フィブロネクチン上に播種、または宿主胚に戻って移植することができる。この技術は、NC上皮から間葉移行、遊走、および分化の機序を研究することができる。
Abstract
神経堤（NC）は、神経胚形成の最後に上皮への間充織転換（EMT）を受けて、過渡背側神経管の細胞集団である様々な臓器に向けて広範囲に移動し、誘導体（ニューロン、グリア、多くのタイプに分化する軟骨や骨、色素性および内分泌細胞）。このプロトコルでは、in vivoおよびin vitroでのNC開発を研究するために、 アフリカツメガエル胚からpremigratory頭蓋NCを分析する方法について説明します。カエルモデルは、初期の開発を研究する多くの利点を提供しています。豊富なバッチは、胚がin vivoでのゲインと機能戦略の損失は前供与体および/ またはホスト胚におけるNC郭清に遺伝子発現の操作を可能にする、迅速な開発、提供しています。 NC植片は、フィブロネクチン上に播種し、インビトロ研究のために使用することができる。これらは、無血清培地中で定義された数日間培養することができる。また、背面のNC植片を移植する方法を説明します生体内でのNCの移行および分化を研究するためのホスト胚へ。
Introduction
神経冠（NC）は、脊椎動物胚における神経胚形成の終了時に神経管から出てくる一過性胚細胞集団である。 NCの仕様を制御するシグナル伝達および遺伝的事象は、早ければ原腸形成として開始します。ノースカロライナ州は、周囲の背側の組織からの信号によって、神経および非神経外胚葉の境界に指定されています。神経胚形成の終了時に、NC細胞が上皮から間葉転換（EMT）を受けると案内手がかりを囲むに応答することによってステレオタイプのルート以下の胚で広く移動する。彼らは彼らの最終的な宛先に到達した後、彼らは誘導体、 例えばニューロン 、グリア、骨、軟骨、および色素性細胞1-5の広大な配列に分化する。多くの細胞種および胚組織への貢献のために、NC細胞開発のどの段階での欠陥は、誘導から最終分化、neurocristopathies 6という先天性の症候群を引き起こす可能性があります。 E様々な段階での開発のNCの新実験操作 – 仕様、EMT、移行、および分化は – neurocristopathiesの我々の理解を向上させ、潜在的な治療戦略の設計ができるようになります。
アフリカツメガエル胚は、NC開発を研究するための最適なモデルです。胚の多数を得るのは容易であり、体外受精は、開発の非常に最初のステップへのアクセスを提供します。多くのツールは、実験的にXを操作するために利用可能である胚発生ツメガエル 。機能獲得型と遺伝子ノックダウンは、初期の胞胚の個々のセルをマイクロインジェクションにより実行するのは簡単です。胚組織は、in vitro再アソシエーション7-11またはバックグラフト12,13のアッセイのために切断することができる。
このプロトコルでは、Xにpremigratory頭蓋NCを分析する方法を説明します移行前に、後半neurulas ツメガエル 。これらの外植片はフィブロネクチンジンジャーブレッドで培養することができるに移行し、分化を研究するDプレートは、in vitroの実験条件で制御。 NC外植片もまた、インビボでそれらの移動および分化を研究するために、通常の操作または宿主胚に移植することができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは、 アフリカツメガエル胚においてpremigratory頭蓋NCを植するための簡単な技術が記載されている。このような実験に使用した胚は、堅牢で、よく治癒する必要があります。不健康な胚のいずれかのバッチを廃棄します。また、後段ではなく、17で神経堤を切除するために、（12〜18〜20℃に）様々な温度で胚を成長する。ステージ17の後に、神経堤は頭部中胚葉と混合して…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者は有用な議論とキュリー研究所の動物施設のためのフィブロネクチン、エリックTheveneau上の外植片の映像のためアデリーヌドリーに感謝します。 CMは、地方イル=ド=フランス（ドメーヌD'Interet Majeurポール幹細胞）、大学パリシュッド（アタッシェTemporaire D'Enseignementら·デ·ルシェルシュ）、および通信社国立·デ·ラ·ルシェルシュのポスドクである。この作品は、大学のパリシュッド（Attractivite 2011）、センター国立·デ·ラ·ルシェルシュ科学研究（アクションThematiqueらIncitativeシュールプログラム）によって資金を供給された、協会はラ·ルシェルシュコントルルがんグラントSFI20101201882、リーグコントルルがん、およびアジャン国立デラを注ぐRECHERCHE（アジャン国立·デ·ラ·ルシェルシュ·プログラム·ブラン）。
Materials
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma | F4759-1MG | |
| Bovine Serum Albumine. Fraction V | Euromedex | 04-100-811-C | Lower quality grade may be suitable for this application |
| Stainless Steel Insect Pins. Size 000 | FST | 26001 | |
| Dumont #5 forceps 0.05 mm x 0.02 mm | FST | 11252-20 |
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