Summary
Den bakterielle celleveggen består av peptidoglykan, et makromolekylært nettverk av sukkerstrenger krysskoblet av peptider. Ultra Ytelse Flytende kromatografi gir høy oppløsning og gjennomstrømning for nye funn av peptidoglykan sammensetning. Vi presenterer en prosedyre for isolering av cellevegger (sacculi) og deres påfølgende forberedelse til analyse via UPLC.
Abstract
Bakteriecelleveggen er kritisk for bestemmelse av celleform under vekst og divisjon, og opprettholder cellenes mekaniske integritet i møte med turgortrykk flere atmosfærer i størrelsesorden. På tvers av de forskjellige formene og størrelsene til bakterieriket består celleveggen av peptidoglykan, et makromolekylært nettverk av sukkerstrenger krysset av korte peptider. Peptidoglykanens sentrale betydning for bakteriefysiologi ligger til grunn for bruken som et antibiotikamål og har motivert genetiske, strukturelle og cellebiologiske studier av hvordan den er robust sammensatt under vekst og deling. Likevel er det fortsatt nødvendig med omfattende undersøkelser for å fullt ut karakterisere de viktigste enzymatiske aktivitetene i peptidoglykansyntese og kjemisk sammensetning av bakterielle cellevegger. Høy ytelse flytende kromatografi (HPLC) er en kraftig analytisk metode for å kvantifisere forskjeller i kjemisk sammensetning av veggene i bakterier dyrket under en rekke miljømessige og genetiske forhold, men gjennomstrømningen er ofte begrenset. Her presenterer vi en enkel prosedyre for isolering og tilberedning av bakterielle cellevegger for biologiske analyser av peptidoglykan via HPLC og Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC), en utvidelse av HPLC som bruker pumper for å levere ultrahøyt trykk på opptil 15 000 psi, sammenlignet med 6000 psi for HPLC. I kombinasjon med utarbeidelsen av bakterielle cellevegger presentert her, vil prøveinjektorene med lavt volum, detektorer med høye samplingsfrekvenser, mindre prøvevolumer og kortere kjøretider for UPLC muliggjøre høy oppløsning og gjennomstrømning for nye funn av peptidoglykansammensetning og grunnleggende bakteriell cellebiologi i de fleste biologiske laboratorier med tilgang til en ultracentrifuge og UPLC.
Introduction
Målet med metoden som er beskrevet her, er å isolere intakte bakterielle cellevegger (sacculi) og fordøye peptidoglykan (PG) slik at Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC) kan brukes til å gi informasjon som identiteten til muropeptidkomponentene og deres konsentrasjoner, gjennomsnittlig lengde på glykanstrenger og brøkdelen av materiale involvert i krysskoblinger mellom tråder. For en detaljert diskusjon av PG biokjemi og muropeptide arter, er det flere gode vurderinger som beskriver PG-struktur og dens rolle i infeksjon, motstand, morfogenese og vekst1-6. High Performance Liquid Chromatography (HPLC) for PG-analyse ble opprinnelig utviklet av Glauner og Schwarz på 1980-tallet, og har nylig blitt forbedret og anvendt mye i laboratoriene til Miguel de Pedro og Waldemar Vollmer. Tidligere metoder benyttet aminosyreanalyse eller papirkromatografi, tidkrevende og kjedelige teknikker som ikke gir nøyaktige eller fullstendige vurderinger av celleveggkomponenter.
UPLC-analyse kan enkelt implementeres i ethvert grunnleggende forskningslaboratorium som har tilgang til en ultracentrifuge og UPLC. UPLC-metoden som vi presenterer nedenfor isolerer komplett sacculi, og gir dermed omfattende, kvantitativ informasjon om alle kjemiske arter der. Denne metoden gir presis kvantifisering av alle muropeptider på tvers av en bakteriepopulasjon, alt innenfor en 20 min UPLC-løp. Implementeringen av denne metoden innebærer bare grunnleggende laboratorieferdigheter, uten betydelige økonomiske investeringer i materialer. For å utføre trinnene i denne metoden trenger forskere bare å være dyktige i pipettering, forberede buffere og enzymer, og justere pH, noe som gjør den tilgjengelig for et bredt spekter av vitenskapelige disipliner. Valget av enzymer som brukes i denne protokollen avhenger av arten av bakterie som analyseres; protokollen beskrevet her er nyttig for Escherichia coli, og har generelt vist seg å være tilstrekkelig for å isolere sacculi fra andre Gram-negative organismer. Konsultasjon med litteraturen anbefales ved bruk av denne metoden på Gram-positive bakterier; i disse artene har sacculus rensing tradisjonelt vært vanskeligere. Spesielt kan denne metoden måtte endres når det gjelder enzymvalg og fordøyelsestid for å imøtekomme de tykkere veggene og tilbehørspolymerene som teichoic syrer av Gram-positive bakterier. Det første enzymet i denne protokollen klemmer ytre membran lipoprotein (som Brauns lipoprotein, eller Lpp) vedlegg til peptidoglykanen, og frigjør dermed alle unntatt C-terminal di- (eller tri-) peptidet til Lpp fra celleveggen. Dette trinnet er nødvendig når du undersøker Enterobacteria, men mange andre Gram-negative bakterier har ingen Lpp-ekvivalenter, og derfor kan dette trinnet hoppes over. Et annet enzym cleaves spesielt etter denmuramiske syrekomponenten i peptidoglykanen, og oppløser disakkaridunderenheten som danner muropeptidarten. For å gi en nøyaktig vurdering av arkitekturen til PG, bør det tas hensyn til å fordøye sacculi for å forhindre spalting av kryssbroene eller andre deler av peptidstammen.
Selv om de kjemiske sammensetningene av peptidoglykan fra over 100 stammer av ~ 40 bakteriearter har blitt analysert av HPLC, er det ikke utført noen analyser med UPLC-teknologi. I tillegg har tidligere arbeid karakterisert peptidoglykan fra bare en liten brøkdel av bakteriedomenet, delvis begrenset av gjennomstrømningen til HPLC. Derfor vil formidling av denne metoden til så mange forskere som mulig, og implementering på UPLC-plattformer, være avgjørende for å drive fysiologiske studier av den store brøkdelen av bakteriearter hvis peptidoglykan ennå ikke er kategorisert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Vokse bakteriekulturer i 2,5 ml media over natten
Back-fortynnede kulturer 1:100 til 250 ml friske medier og vokse til OD600 av 0,7-0,8. Forbered en løsning av 6% natriumdedylsulfat (SDS) i vann.
FORSIKTIG: SDS-pulver er farlig - unngå innånding av SDS-pulver; bruk maske over nese og munn.
2. Dag 1 - Lysing Bakteriekulturer utføres i løpet av en dag og over natten
- Mens fortynnede kulturer vokser, sett opp et kokende vannbad på en varm tallerken i et 1 L beger. Når vannet kokes, tilsetter aliquot 6 ml 6% SDS i 50 ml polypropylenrør, tilsett en liten rørstang til hvert rør, fest rørlokkene til fingertett, plasser rørene i vannbadet og slå på omrøring til 500 rpm på varmeplaten.
- Høst de 250 ml kulturene ved 5000 × g i 10 minutter ved romtemperatur og resuspendpellets i 3 ml medier eller 1x fosfatbufret saltvann. Pipette celle suspensjoner sakte inn i 50 ml rør med 6% kokende SDS for å lyse cellene (endelig konsentrasjon 4% SDS) mens rørene er nedsenket i kokende vannbad, og reclose lokker til finger-tett. Cellesuspensjoner må raskt overføres til kokende SDS når de er resuspendert. Brå miljøendringer bør unngås, da dette kan føre til feilaktig endring av celleveggstrukturen.
- Dekk kokende vannbad og la cellene koke i 3 timer, kontroller vannstanden med jevne mellomrom og fyll på vannbadet når det er nødvendig. Etter 3 timer, slå av varmeelementet på varmeplaten, og fortsett å røre over natten ved 500 rpm.
3. Dag 2 - Enzymatiske fordøyelser utføres i løpet av en dag
- Hvis SDS har utfelt i 50 ml rørene over natten, sett vannbadet til å koke i ytterligere 1-2 timer. Slå på en varmeblokk til 60 °C. Forbered en 1 mg/ml lager av Pronase E i 10 mM Tris-HCl (pH 7,2) + 0,06% m/v NaCl og aktiver Pronase E ved 60 °C i minst 30 minutter.
- Bruk et ultrasenterrifugesett på 400 000 × g for å spinne prøver i 20 minutter ved romtemperatur for å pellet de store PG-polymerene og dermed rense dem fra andre cellulære komponenter. Fjern supernatanten forsiktig, og resuspender deretter hver pellets i romtemperatur ultrapure vann. MERK: Spenningsvolumet avhenger av volumet på ultracentrifuge rørene som brukes; bruk et volum som fyller rørene minst halvveis, men ikke overstiger det maksimale volumet på rørene. Gjenta sentrifugering/vasking til vannet ikke danner bobler under resuspension, noe som indikerer at SDS er fullstendig fjernet (vanligvis tre vasker). Slutt å vaske pelletsen hvis et hvitt bunnfall dannes, da dette indikerer at sacculi klumper seg sammen. Klumping er ikke katastrofalt, men klumper binder seg veldig sterkt til plast og glass som forårsaker stort prøvetap. I dette tilfellet fortsetter du med protokollen ved hjelp av den klumpede sacculi-prøven.
- På det siste sentrifugerings-/vasketrinnet bruker du prøvene på nytt i 900 μl 10 mM Tris-HCl (pH 7,2) + 0,06% m/v NaCl og overføres til 2 ml rør som tidligere var stikket med hull i toppene med en liten nål. Tilsett 100 μl 1 mg/ml aktivert Pronase E (100 μg/ml endelig konsentrasjon) til hver prøve og inkuber ved 60 °C i 2 timer. Sett en annen varmeblokk til 100 °C.
- Stopp Pronase E-fordøyelsen ved å tilsette 200 μl 6% SDS til hver prøve og kok prøvene i 100 °C varmeblokken i 30 minutter. Sett en annen varmeblokk til 37 °C og lag en 1 mg/ml bestand av muramidase (mutanolysin) i 50 mM fosfatbuffer (pH 4,9).
- Som i trinn 3.2, bruk en ultracentrifuge satt til 400.000 × g for å spinne prøver i 20 minutter ved romtemperatur og vask med romtemperatur ultrapure vann til SDS er helt fjernet (vanligvis tre vasker). Resuspension volum avhenger av volumet av ultracentrifuge rør som brukes; bruk et volum som fyller rørene minst halvveis, men ikke overstiger det maksimale volumet på rørene.
- På det siste sentrifugerings-/vasketrinnet resuspendprøver i 200 μl av 50 mM natriumfosfatbuffer (pH 4,9). Dette volumet kan justeres i henhold til mengden peptidoglykan i prøven, og kan være artsavhengig. Hvis det tidligere er publiserte rapporter om HPLC-analyse for arter av interesse, kan dette volumet estimeres basert på disse kvantumene (en samling av HPLC PG-studier finnes i tilleggsinformasjonen for referanse7). For andre arter kan sacculus prep utføres opp til dette trinnet, og deretter kan forskjellige mengder resuspension volumer legges til for å gjenskape prøver for å bestemme det minimale volumet som gjør at PG forblir i løsning (se Diskusjon for ytterligere estimater). Hvis prøven inneholder mer peptidoglykan, øker du resuspensasjonsvolumet. Hvis prøven har lite peptidoglykan, reduser resuspensasjonsvolumet til minst 50 μl.
- Overfør prøver til 1,5 ml rør og tilsett 1 mg/ml muramidase for å gi en endelig konsentrasjon på 40 μg/ml. Inkuber 6-8 timer eller over natten ved 37 °C.
4. Dag 3 - Forberedelse av prøver for UPLC utføres på den siste dagen
- Slå på en varmeblokk til 100 °C. Kok prøvene uten SDS i 5 min for å stoppe muramidase fordøyelsen. Sentrifugeprøver i 10 min ved 16.000 × g ved romtemperatur, og overfør deretter supernatanten (muropeptider er nå løselige) til 13 mm x 100 mm glassrør. Prøv å gjenopprette så mye supernatant som mulig, komme veldig nær pellet uten å forstyrre det.
- Juster pH ved å tilsette 500 mM boratbuffer (pH 9) i prøven for en endelig konsentrasjon på 100 mM boratbuffer. Boratbufferen er kompatibel med reduksjonsmiddelet natriumborohydrid. Tilsett 1-2 korn natriumborohydrid for å redusere hver prøve og la reaksjonen fortsette i minst 30 minutter ved romtemperatur. FORSIKTIG: Natriumborohydrid er svært reaktivt og farlig å håndtere - unngå kontakt med huden (bruk hansker) og unngå kontakt med øynene (bruk vernebriller).
- Juster prøver til pH 3-4 (muropeptid isoelektrisk punkt er ~ 3,5) med 50% v / v ortopofosforsyre ved hjelp av 20 μl trinn til pH 6, målt med pH-indikatorpapir, og bruk deretter 2 μl trinn. FORSIKTIG: Ortopofosforsyre er etsende og farlig å håndtere - unngå kontakt med huden (bruk hansker) og unngå kontakt med øynene (bruk vernebriller). Prøven skal boble som svar på tilsetning av ortopofosforsyre; Når prøven slutter å boble, indikerer dette vanligvis at en pH på 6 er nådd. Hvis det ikke oppstår boblende i prøven, kan dette tyde på at mengden natriumborohydrid tilsatt var for liten. I dette tilfellet, slutt å senke pH, legg forsiktig til ett eller to korn natriumborohydrid, la reagere i 5-10 min, og fortsett deretter pH-justeringen.
- Filterprøve gjennom et 0,22 μm sprøytefilter direkte inn i et UPLC-hetteglass. Hvis det har dannet seg et bunnfall, varmes røret med flere passerer gjennom en flamme før filtrering. Hvis prøven ikke injiseres i UPLC-instrumentet i løpet av dagen, fryser du ved -20 °C over natten. Prøver kan lagres i opptil et år ved -80 °C. Prøven kan tines ved å passere gjennom en flamme flere ganger.
- Injiser 10 μl av hver prøve på et UPLC-instrument utstyrt med en C18 1,7 μm omvendt fasekolonne og en absorbansdetektor satt til å overvåke 202-208 nm. Prøver injiseres sekvensielt, men autosampler-funksjoner gjør det mulig å behandle opptil 96 prøver satsvis. Bruk 50 mM natriumfosfat (pH 4,35) + 0,4 % v/v natriumazid til oppløsningsvæske A, og 75 mM natriumfosfat (pH 4,95) + 15 % v/v metanol til løsningsmiddel B. MERK: Natriumazid tilsettes for å kompensere for 205 nm absorpsjon av metanol for å unngå baseline drift. Sett strømmen til 0,25 ml/min og bruk en lineær gradient over 25 min for å oppnå 100% løsningsmiddel B og sekvensiell elutasjon av muropeptider innen 30 minutter. Hvis massespektrometri vil bli brukt til å karakterisere muropeptider etter UPLC, samle brøkdeler av toppen av interesse i en brøkdel samler og tørk fraksjonene ved hjelp av en sentrifugal fordamper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjelp av prosedyren som er beskrevet i figur 1, bør den endelige prøven bestå av minst 200 μl klar oppløsning som er filtrert direkte inn i et UPLC-hetteglass (trinn 4.4). UPLC-separasjon av de ulike muropeptider i en bakterieprøve er avhengig av deres relative løselighet mellom den flytende mobile fasen og kolonnens stasjonære fase. Omvendt fase C18 kolonner gir en sterkt hydrofob matrise for å skille muropeptide arter basert på hydrofobiskhet og størrelse8; polare monomerer med lav molekylvekt eluteres først, og apolar, høyere molekylvekt oligomerer elutere etter (Figur 2). Et typisk UPLC-resultat er vist i figur 2, med deteksjon via UV-absorbans ved 202-208 nm som en funksjon av tid som etablerer en bestemt muropeptids oppbevaringstid. Dette representative resultatet viser klar oppløsning mellom de fleste muropeptidarter og sterk signalstyrke over hele spekteret, noe som muliggjør analysiz og gjennomsnittlig glykanstrenglengde.
Det siste trinnet som er skissert i figur 1, innebærer justering av pH og filtrering av fine partikler som kan tette de små dimensjonene på slangen som brukes i UPLC. Hvis en prøve er superkonsentrert, for eksempel ved å resuspendere i 100 μl natriumfosfatbuffer i trinn 3,5 i stedet for 200 μl, kan prøven bli overskyet, noe som indikerer at en kritisk konsentrasjon er oppnådd og muropeptidene har utfelt. Dette tapet av løselighet vil resultere i tilstopping av sprøytefilteret som brukes i trinn 4.4, og forhindrer avsetning av muropeptider i UPLC-hetteglasset og / eller tilstopping av UPLC-maskinledningene og kolonnen, som er kostbare gjenstander å erstatte. Et eksempel på et kromatogram som gjenspeiler denne avvikende prøvebehandlingen, vises i figur 3. ingen topper unngikk, noe som resulterte i fravær av data om PG-sammensetning. Feiljustering av pH til godt under det isoelektriske punktet i muropeptidene (f.eks. til en pH på 2) kan også føre til utfelling av muropeptider og dermed fravær av merkbare topper fra UPLC-analyse.
Figur 1. Skjematisk av sacculi forberedelse. Denne metoden er avhengig av iterative runder med ultracentrifugation for å rense SDS bort fra pelleted sacculi.
Figur 2. Eksempel UPLC-kromatogram av PG fra sacculi fordøyd fra E. coli MG1655 celler. Vær oppmerksom på at sammenlignbar oppløsning av alle muropeptider oppnås i 10% av tiden for en typisk HPLC-kjøring. Muropeptide etiketter - M = monomer, D = dimer, T = trimer; (2,3,4,5) indikerer antall aminosyrestammepeptider; modifikasjoner - G = glycin som erstatter L-alanin, L = to ekstra aminosyrer fra Pronase E-spalting, D = 3,3-diaminopimelic acid (DAP)-DAP crossbridge, N = avslutte anhydro-muropeptid. For eksempel er D33DL en dimer med 3-aa stammepeptider, koblet gjennom en DAP-DAP crossbridge, som inneholder ytterligere to aminosyrer fra Pronase E-spalting.
Figur 3. Mislykket UPLC-analyse av sacculi fordøyd fra E. coli MG1655 celler. Fraværet av topper, som indikerer at det ikke var noen muropeptider til stede i prøven, skyldes at muropeptider krasjer ut av løsningen før utvinning til et UPLC-hetteglass (trinn 4.4). Denne nedbøren kan ha vært på grunn av overkonsentrasjon av muropeptider eller at pH er for lav.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Et kritisk trinn i denne prosedyren er trinn 3.1 i den andre dagen med prøvepreparering. Hvis SDS har utfelt over natten, eller hvis prøvene har vært lagret i 4% SDS i flere uker ved romtemperatur, må prøvene kokes i minst 1 time for å løse SDS. En vanlig årsak til SDS-nedbør er bruk av medier med kaliumsalter, så kalium bør unngås i media om mulig. Som nevnt i delen Representative Resultater, er det også viktig å justere pH til innenfor det isoelektriske punktet til muropeptider (~ 3,5), men ikke for mye lavere enn pH 3, eller materialet kan utfelle. Til slutt må resuspension av prøven forekomme i riktig volum natriumfosfatbuffer (trinn 3.5), som må dømmes av forskeren. Når du velger resuspensjonsvolumet av natriumfosfatbuffer, er det viktig å vurdere hvor mye muropeptidmateriale som sannsynligvis vil bli generert fra en bestemt bakteriekultur. For eksempel, hvis det endelige kulturvolumet er 250 ml, som beskrevet ovenfor, må prøven brukes på nytt i minst 200 μl natriumfosfatbuffer. Hvis forskeren endrer metoden til 50 ml kulturer, kan prøver brukes på nytt i 100 μl natriumfosfatbuffer eller mindre. Vurdering av de anslåtte mengdene peptidoglykan i en art er også viktig; For eksempel inneholder E. coli spheroplasts vesentlig mindre peptidoglykan (ca. 7% av mengden i wild-type E. coli-celler 10), og så er resuspension i 100 μl eller mindre natriumfosfatbuffer hensiktsmessig. Hvis det er vanskelig å dyrke en viss bakterieart eller belastning på store mengder (250 ml), kan det endelige kulturvolumet reduseres og/eller fortynning av nattkulturen kan reduseres. Til slutt krever injeksjon på et HPLC-system et minimumsvolum på 200 μl, mens 10 μl er tilstrekkelig for et UPLC-system.
Rensing av PG-komponenter i forskjellige organismer eller for forskjellige applikasjoner kan justeres ved å variere typen mobilfase, kolonne og gradient på UPLC-instrumentet. Mobile faser som er løsningsmiddelbaserte, som acetonitril, kan brukes til å avsalte prøver før massespektrometri. Ulike kolonnekjemier kan også være nødvendig for å avsalte prøver grundig for etterfølgende analyse. Figur 2 viser den vanlige elutionprofilen til muropeptider for gram-negativ stangformet bakterie E. coli MG1655; Analysen av PG fra Gram-positive bakterier og/eller arter med andre former kan kreve finjustering av gradienten som er skissert i trinn 4.5. Selv om UPLC-spektra som det som vises i figur 2 genererer mange informasjonsklasser om peptidoglykan, for eksempel muropeptididentitet, krysskoblingsprosent og glykanstrenglengde, har metoden flere begrensninger, inkludert manglende evne til å kartlegge den romlige fordelingen av strukturelle egenskaper på tvers av sacculi. For eksempel kan verken plasseringen av kryssing langs en glykankjede eller plasseringen av bundne lipoproteiner ses via HPLC eller UPLC.
Fordelene ved å analysere den kjemiske sammensetningen av PG med HPLC inkluderer høyere oppløsning, kortere analysetid og nøyaktig kvantum11 sammenlignet med tradisjonelle teknikker som aminosyreanalyse12-14 eller papirkromatografi15,16. UPLC gir høyere hastighet og følsomhet enn HPLC på grunn av høyere trykk som muliggjør raskere strømninger og dermed kortere kjøretider. Oppløsning ofres ikke med UPLC, da kolonnene under 2 μm partikkelstørrelse, høye samplingsfrekvensdetektorer og lavvoluminjektorer er i stand til å motstå svært høyt trykk og dermed fungere nøyaktig ved høye hastigheter17,18. Dette resulterer i muligheten til å analysere prøvevolumer på 1 μl i titalls minutter, sammenlignet med 200 μl og timer for HPLC.
Teknikker som er komplementære til UPLC inkluderer muropeptid masseanalyse ved massespektrometri. UPLC er ikke en destruktiv teknikk; eluate fra kolonnen kan samles etter UV-deteksjon og tørkes ved hjelp av en sentrifugal fordamper som vanligvis er tilgjengelig i de fleste laboratorier. Selv om prøven kan avsaltes for å forberede den på massespektrometri (trinn 4.5), Matrix Assisted Laser Desorption / Ionization - Time Of Flight Mass Spectrometry muliggjør analyse uten mye følsomhet for saltkonsentrasjon19, og gir massedata som er i stand til endelig identifisering av muropeptider. Kostnaden ved å forberede en celleveggprøve for UPLC er omtrent $ 6-7, inkludert kostnadene for enzymer, kjemikalier og forsyninger som brukes. Gitt sine rimelige driftskostnader, tilgjengelighet og demonstrert verktøy for studier av bakteriell cellevegg, bør UPLC bli den valgte metoden for høyoppløselig, høy gjennomstrømning, nøyaktig kvantifisering av peptidoglykansammensetning over hele bakterieriket.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Produksjonskostnadene for denne artikkelen ble sponset av Waters Corporation.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av NIH Director's New Innovator Award DP2OD006466 (til K.C.H.). Forfatterne takker Russell Monds for en praktisk demonstrasjon av metoden og for vitenskapelige diskusjoner.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pronase E | Amresco | E629 | |
| Mutanolysin from Streptomyces | Sigma-Aldrich | M9901 | |
| Sodium borohydride (NaBH4) | Sigma-Aldrich | 452882 | Sodium borohydride is highly reactive and dangerous to handle |
| Orthophosphoric acid | Sigma-Aldrich | 79607 | Orthophosphoric acid is corrosive and dangerous to handle |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | 31146 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Sodium azide is a poison |
| Sodium tetraborate | Sigma-Aldrich | 221732 | |
| Millex 0.22 μm syringe filters | Fisher | SLGVR04NL | |
| pH strips (pH range 0-6) | Fisher | M95863 | |
| 50 ml polypropylene Falcon tubes | VWR | 21008-951 | |
| 13 mm x 100 mm glass tubes | Kimble Chase | 60CM13 | |
| 12 mm x 32 mm screw neck glass recovery vial | Waters | 186000327C | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Ambion | AM9820 | SDS powder is hazardous |
| Instrumentation | |||
| Waters Acquity UPLC H-Class system, including: | |||
| Acquity UPLC H-Class Sample Manager FTN | |||
| Acquity UPLC H-Class Quaternary Solvent Manager | |||
| Acquity UPLC BEH C18 1.7 µm column | |||
| Acquity UPLC PDA Detector | |||
| Waters Fraction Collector III | |||
| Acquity UPLC 30 cm Column Heater/Cooler |
References
- den Blaauwen, T., de Pedro, M. A., Nguyen-Disteche, M., Ayala, J. A.
- Holtje, J. V. Growth of the stress-bearing and shape-maintaining murein sacculus of Escherichia coli. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62, 181-203 (1998).
- Typas, A., Banzhaf, M., Gross, C. A., Vollmer, W. From the regulation of peptidoglycan synthesis to bacterial growth and morphology. Nat. Rev. Microbiol. 10, 123-136 (2011).
- Vollmer, W., Blanot, D., de Pedro, M. A.
- Davis, K. M., Weiser, J. N. Modifications to the peptidoglycan backbone help bacteria to establish infection. Infect. Immun. 79, 562-570 (2011).
- Healy, V. L., Lessard, I. A., Roper, D. I., Knox, J. R., Walsh, C. T. Vancomycin resistance in enterococci: reprogramming of the D-ala-D-Ala ligases in bacterial peptidoglycan biosynthesis. Chem. Biol. 7, 109-119 (2000).
- Desmarais, S. M., De Pedro, M. A., Cava, F., Huang, K. C. Peptidoglycan at its peaks: how chromatographic analyses can reveal bacterial cell wall structure and assembly. Mol. Microbiol. 89, 1-13 (2013).
- Glauner, B., Holtje, J., Schwarz, U.
- Glauner, B. Separation and quantification of muropeptides with high-performance liquid chromatography. Anal. Biochem. 172 (2), 451-464 (1988).
- Joseleau-Petit, D., Liebart, J. C., Ayala, J. A., D'Ari, R. Unstable Escherichia coli L forms revisited: growth requires peptidoglycan synthesis. J. Bacteriol. 189, 6512-6520 (2007).
- Hakenbeck, R., Holtje, J. V., Labischinski, H. The target of penicillin: the murein sacculus of bacterial cell walls architecture and growth. , Walter De Gruyter Incorporated. (1983).
- Boylen, C. W., Ensign, J. C. Ratio of teichoic acid and peptidoglycan in cell walls of Bacillus subtilis following spire germination and during vegetative growth. J. Bacteriol. 96, 421-427 (1968).
- Sutow, A. B., Welker, N. E. Chemical composition of the cell walls of Bacillus stearothermophilus. J. Bacteriol. 93, 1452-1457 (1967).
- Wang, W. S., Lundgren, D. G. Peptidoglycan of a chemolithotrophic bacterium, Ferrobacillus ferrooxidans. J. Bacteriol. 95, 1851-1856 (1968).
- de la Rosa, E. J., de Pedro, M. A., Vazquez, D. Penicillin binding proteins: role in initiation of murein synthesis in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 5632-5635 (1985).
- Kandler, O., Schleifer, K. H., Dandl, R. Differentiation of Streptococcus faecalis Andrewes and Horder and Streptococcus faecium Orla-Jensen based on the amino acid composition of their murein. J. Bacteriol. 96, 1935-1939 (1968).
- Kumar, A., Saini, G., Nair, A., Sharma, R. UPLC: a preeminent technique in pharmaceutical analysis. Acta Poloniae Pharmaceutica. 69, 371-380 (2012).
- Wilson, I. D., et al. High resolution "ultra performance" liquid chromatography coupled to oa-TOF mass spectrometry as a tool for differential metabolic pathway profiling in functional genomic studies. J. Proteome Res. 4, 591-598 (2005).
- Wieser, A., Schneider, L., Jung, J., Schubert, S. MALDI-TOF MS in microbiological diagnostics-identification of microorganisms and beyond (mini review). Appl. Microbiol. Biotechnol. 93, 965-974 (2012).
