Summary
Membran proteinleri izole etmek ve tanımlamak zordur çünkü koklear duyu epitel Proteom analizi nedeniyle küçük boyutu ve zor olabilir. Zar ve çözülebilir proteinler, her ikisi de yüksek çözünürlüklü kütle spektrometrisi ile birlikte birden hazırlama yöntemleri ve ayırma teknikleri birleştirilerek tanımlanabilir.
Abstract
Proteomiks karmaşık biyolojik sistemlerin içgörü sağlayabilir yaygın olarak kullanılan bir yaklaşımdır. Koklear duyusal epitelyum, periferal ve merkezi sinir sistemi tarafından işlenen bir elektro-kimyasal enerjiye sesin mekanik enerji transdüksiyonu reseptörlerini içerir. Çeşitli proteomik teknikler, iki boyutlu bir fark jel elektroforezi (2D-DIGE), antikor mikrodizi ve kütle spektrometrisi (MS) halinde koklear iç kulak, çalışma için geliştirilmiştir. MS proteomikteki en kapsamlı ve çok yönlü bir araçtır ve ayırma yöntemleri ile birlikte biyolojik örneklerin derinlemesine bir proteomesini sağlayabilir. MS ile birlikte ayırma yöntemleri, protein örnekleri ettirecek düşük bir molekül ağırlığı ve hidrofobik proteinleri tespit ve proteom dinamik aralığını azaltarak düşük bol proteinleri tespit etmek yeteneğine sahiptir. Farklı sindirim stratejiler peptid ve protein geliştirmek için bütün lisat ya da parçalanmış protein lisatı uygulanabilirdizisi kapsama. Güçlü katyon alışveriş (SCX), ters faz (RP) ve jel elüt sıvı fraksiyon tuzak elektroforezi (GELFrEE) dahil olmak üzere farklı ayırma tekniklerinin kullanımı protein belirlenmesi için önceki MS analizi için numune karmaşıklığını azaltmak için uygulanabilir.
Introduction
Proteomiks protein ifadesi, işlev, değişiklik ve etkileşimleri 1 analiz karmaşık biyolojik sistemlerin çalışmadır. Çeşitli yöntemler, antikor mikrodizi 2, iki boyutlu jel elektroforezi 3-5 ve dige 6 da dahil olmak üzere, iç kulak bölgesinin proteom analizi için kullanılmıştır. Bununla birlikte, proteinlerin sadece sınırlı sayıda tespit edilmiştir ve iç kulak 11,12 belirlenen genler ve 10.000 'den fazla edilen sunulan sekans bölümlerinin (EST) ile karşılaştırıldığında, 2,7-10, özelliği, MS, en yaygın olarak kullanılan ve kapsamlı bir tekniktir protein karakterizasyonu için proteomikteki. Gibi koklea gibi karmaşık proteomik numunelerin, analiz, zor olabilir. Bununla birlikte, MS ile birden fazla ayırma tekniklerinin bir kombinasyonu nedeniyle artan bir dinamik konsantrasyon aralığında ve en yüksek kapasite 13, peptidlerin ve proteinlerin, bir daha fazla sayıda tanımlanmasını sağlar. Çok boyutlu kromatografikphy farklı adsorpsiyon mekanizmalarının kullanımına izin vererek son derece kompleks protein karışımları azaltır. İki sık kullanılan MS proteomdaki çözümleme yaklaşımları, av tüfeği ve aşağıdan yukarıya proteomiks vardır. Av tüfeği proteomik, sağlam proteinlerin bir karışımı enzimatik olarak sindirilir ve güçlü katyon değişim kromatografisi, ters faz sıvı kromatografisi (RPLC) 14,15 ve ardından (SCX) ile çok boyutlu kromatografi kullanılarak ayrılır. Ayrılmış peptidler tandem MS tabi ve veritabanı 15 arıyor. Bu tekniğin önemli bir avantajı protein binlerce tek analizinde tespit edilebilir ve teknik membran proteinleri için daha uygun olmasıdır.
Aşağıdan yukarıya yaklaşımda, protein kanşım genellikle bir ya da iki boyutlu elektroforez ile ayrılır, ve tek tek protein bantları ya da noktalar genellikle birden peptidler ile sonuçlanır, tripsin gibi bir enzim ile kesilir ve sindirilmiştir. Ancak, başka bir daha yenily aşağıdan yukarıya proteomikteki kullanılan elektroforetik yaklaşım geliştirdi, GELFrEE olduğunu. Bu teknik, sıvı-faz içinde protein örnekleri böler ve analizden önce için daha az karmaşık hale getirir. Bu teknik, tekrar üretilebilir yüksek protein iyileşme sağlar ve karmaşık protein örnekleri 16 yüksek fazla proteinler dağılımını azaltır. Ayrılmış proteinlerinden elde edilen peptidler, 17-19 veritabanı arama için sekans etiketler oluşturmak için, peptid kütle parmak izi ya da tandem MS (MS / MS) kullanılarak, MS ile analiz edilir. Aşağıdan yukarıya yaklaşım kullanarak önemli avantajlarından bazıları yüksek çözünürlüklü ayrımları ve kapsamlı protein kapsama almak için yeteneği vardır. Aşağıdan yukarıya proteomiks proteomiks 20 en çok kullanılan tekniktir, dolayısıyla, çeşitli biyoinformatik araçları mevcuttur. Buna ek olarak, proteinler, sindirim önce bir karışım olarak ayrılabilir, böylece daha büyük bir kimlik olasılığı vardır.
Önemli sorunlardan biriproteomik analizi için iç kulağı kullanarak kendi küçük boyutu, sınırlı erişilebilirlik ve hücre tipi çeşitlilik 21'dir. Buna ek olarak, bu tür iyon kanalları, taşıyıcı ve reseptör olarak özelliğe ayırt anahtar proteinler, 22, izole etmek zor olabilir zar proteinleri vardır. Bu nedenle, filtre destekli numune hazırlama (FASP) protein çıkarımı için sınırlıdır dokuların proteomik analizler için avantajlıdır ve membranlar 23 çözündürülmesi için deterjan gerektirir. Bu filtre membran ve çözünebilir proteinlerin MS analizi için ve düşük molekül ağırlıklı kirletici 23,24 peptidler izole etmek yeteneği sağlar.
Mevcut protokol birleştirildi ve çözünebilir ve membran proteinleri de analiz etmek ve koklear duyu epitel protein kimliklerinin sayısını arttırmak için modifiye sık kullanılan proteomik yaklaşımlar anlatılmaktadır. Biz FASP çok sindirimi ile av tüfeği proteomiks kullanarak anlatacağıziyon, iyon değiştirme kromatografisi, yüksek çözünürlüklü MS ve veri analizi. Buna ek olarak, biz GELFrEE, FASP çok sindirim, yüksek çözünürlük MS, ve veri analizi ile aşağıdan yukarıya proteomiks anlatacağız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik Bildirimi
Ulusal Sağlık Enstitüleri kurallar altında belirtilen farenin dokusunu kullanarak deneyler Güney Florida Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (Protokoller 3931R, 3482R) tarafından onaylanmıştır.
1.. Protein Ekstraksiyon
- -80 ° C'de 16 30-günlük-eski (P30) CBA / J fareler ve mağaza koklear duyu epiteli izole
- Deney gününde, 1 x fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) içinde 500 ul doku yıkayın. 1000 x g'de 3 dakika boyunca santrifüj ve supernatant çıkarın. Üç yıkamadan bir toplam için tekrarlayın.
- 50 mM Tris-HCI, pH 8.0, 120 mM NaCI, 50 mM NaF, 5 mM EDTA, 500 ug / ml AEBSF, 10 ug / ml löpeptin, 100 ug / ihtiva eden liziz tamponu içinde 100 ul buz üzerinde 30 saniye süreyle sonikasyon doku bir ses Dismemrator (; Thermo Fisher Model 100) kullanılarak ml pepstatin, 2 ug / ml aprotinin, 0.5 ug / ml mikrosistin. Buz üzerinde serin lizatHer bir sonikasyon arasında 1 dakika için. 3x toplam sonikasyon.
- 2 dakika boyunca 4 ° C'de 750 x g'de santrifüj özü ve yeni bir mikrotüp süpernatantı. Buz üzerinde 30 saniye boyunca sonike ile liziz tamponunda 50 ul pelet ekstrakte edin. 2 dakika boyunca 4 ° C'de 750 x g'de santrifüjleyin özü. 60 dakika boyunca 4 ° C'de 28,600 x g'de santrifüj lizatları ve hem de bir araya getirin. Yeni mikrotüpe Süpernatantı ve pelet% 0.1 ASB-14 içeren 20 ul lizis tamponu ekleyin. Vortex 1 dakika boyunca, 4 ° C'de 60 dakika boyunca inkübe
- 60 dakika boyunca 4 ° C 'de soğuk, daha sonra 5 dakika boyunca 95 ° C' de örnek ısıtın. 10 dakika boyunca 25 ° C'de 16,000 x g'de santrifüj ile takip edin. Süpernatan toplamak ve yeni bir tüpe aktarılır.
- 5 dakika boyunca 4 ° C'de 16,000 x g'de santrifüj ve süspansiyon sindirim için supernatant saklayın.
2. FASP kullanarak Tüm lisatı çift triptik sindirim Protein
- Bir 30 μ ekleme% 4 sodyum dodesil sülfat (SDS) içeren koklear protein ekstresi, (400 ug ≤) l kısım, 100 mM Tris-HCI, doğrudan 30K eğirme filtreye pH 7.6 ve 0.1 M ditiyotreitol (DTT) ve 8 200 ul ile karıştırın Tris-HCl M üre. 15 dakika boyunca 14.000 x g'de santrifüj.
- 15 dakika boyunca 14,000 x g'de 8 M üre çözeltisi ve 200 ul santrifüj ile konsantre seyreltin.
- 1 dakika için filtre ve girdap konsantreye 8 M üre çözeltisi 10x iyodoasetamit (IAA) 10 ul ekle. 10 dakika boyunca 14,000 x g'de santrifüj ile ve ardından karanlıkta, oda sıcaklığında (RT) 20 dakika boyunca santrifüj filtre inkübe edin.
- 15 dakika boyunca 14,000 x g'de filtre ünitesine ve santrifüj üzerindeki konsantresine 8 M üre çözeltisi 100 ul ekleyin. Bu adım 2x tekrarlayın. 50 mM amonyum bikarbonat, 10 dakika 14,000 x g'de filtre ünitesine ve santrifüj (ABC) çözeltisi 100 ul ekle. Bu adım 2x tekrarlayın.
- 1:100 içinde tripsin 0.4 ug / ul (a / a) enzim için-Protein oranı ve 37 ° C de bir gece (O / N) inkübe
- İnkübasyondan sonra, 10 dakika boyunca 14,000 xg'de santrifüj filtre ünitesi ve 50 mM ABC çözeltisi 40 ul ekle. Bu adım, 1x tekrarlayın.
- 10 dakika boyunca 14,000 xg'de santrifüj filtre ve santrifüj 0.5 M NaCl solüsyonu 50 ul ekle. Yeni bir mikrotüp triptik peptitler içeren filtrat transferi ve sindirim durdurmak için% 1.0 formik asit (FA) ile asitlenir.
- 8 M üre, 40 ul filtre ünitesi yıkayın ve daha sonra 40 ul 18 M, su ile 2 kez yıkanır.
- 50 mM ABC çözeltisi 100 ul ile filtre ünitesi 3 kez yıkayın. En son yıkama 1:100 (w / w), enzim için protein oranında tripsin 0.4 ug / ul ekleyin ve 37 ° C'de O / N sonra inkübe
- 10 dakika boyunca 14,000 x g'de filtre ünitesine ve santrifüj 50 mM ABC çözeltisi 40 ul ekleyerek sindirimi ikinciden triptik peptidlerin elüsyonu. Bu adım, 1x tekrarlayın.
- 0.5 M NaCl çözeltisinin 50 ul ekle10 dakika boyunca 14,000 xg'de santrifüj ve filtre birimi. Yeni bir mikrotüp triptik peptitler içeren filtrat aktarın ve% 1.0 FA ile asitleştirin.
- Numuneler, standart olarak BSA kullanılarak mikro kolorimetrik deneyi kullanılarak ölçülebilir.
3. FASP kullanarak Tüm lisatı Endoproteinaz lysC ve Protein triptik sindirim
- Doğrudan bir 30K eğirme filtresi 4% SDS, 100 mM Tris-HCI, pH 7.6, 0.1 M DTT içeren koklear protein ekstresi, 30 ul bir kısım (400 ug ≤) ekleyin ve Tris-HCl, 8 M üre, 200 ul ile karıştırın . 15 dakika boyunca 14.000 x g'de santrifüj.
- 15 dakika boyunca 14,000 x g'de 8 M üre çözeltisi ve 200 ul santrifüj ile konsantre seyreltin.
- 1 dakika için filtre ve girdap konsantreye 8 M üre çözeltisi 10x IAA 10 ul ekle. Karanlıkta oda sıcaklığında 20 dakika boyunca inkübe edin eğirme filtresi daha sonra 10 dakika boyunca 14,000 xg'de santrifüj.
- 8 M üre çözeltisi 100 ul ekle15 dakika boyunca 14,000 x g'de filtre ünitesine ve santrifüj üzerindeki konsantreye ution. Bu adım 2x tekrarlayın. 10 dakika boyunca 14,000 x g'de filtre ünitesine ve santrifüj 100 mM ABC çözeltisi 100 ul ekleyin. Bu adım 2x tekrarlayın.
- 1:50 (a / a) enzim için protein oranında endoproteinaz lysC 0.1 ug / ul ilave edin ve 30 ° C'de O / N inkübe
- İnkübasyondan sonra, 10 dakika boyunca 14,000 x g'de filtre ünitesine ve santrifüj 100 mM ABC çözeltisi 40 ul ekle. Bu adım, 1x tekrarlayın.
- 10 dakika boyunca 14,000 xg'de santrifüj filtre ve santrifüj 0.5 M NaCl solüsyonu 50 ul ekle. Taze mikrotüpe IvsC'deki peptidler içeren süzüntü aktarın ve sindirim durdurmak için% 1.0 FA ile asitleştirmek.
- 8 M üre, 40 ul filtre ünitesi yıkayın ve daha sonra 40 ul 18 M, su ile 2 kez yıkanır.
- 50 mM ABC çözeltisi 100 ul ile filtre ünitesi 3 kez yıkayın. Son yıkama tripsin 0.4 ug / ul ekledikten sonra 1:100 enzim-to-proproteindir oranı ve 37 ° C'de O / N inkübe
- 10 dakika boyunca 14,000 x g'de filtre ünitesine ve santrifüj 50 mM ABC çözeltisi 40 ul ekleyerek triptik peptidlerin elüsyonu. Bu adım, 1x tekrarlayın.
- 10 dakika boyunca 14,000 x g'de filtre ünitesine ve santrifüj 0.5 M NaCl solüsyonu 50 ul ekle. Yeni bir mikrotüp triptik peptitler içeren filtrat aktarın ve% 1.0 FA ile asitleştirmek.
- Numune, standart olarak BSA ile mikroplaka kolorimetrik deneyi kullanılarak ölçülebilir.
4. Spin sütunları kullanma Tuzsuzlaştırma peptidler
- 1 dakika boyunca 1100 x g asetonitril (ACN) ve santrifüj 500 ul ekleyerek, bir C 18 kolonu MacroSpin etkinleştirir. Santrifüj sonrası akış-through atın.
- 1 dakika boyunca 1100 x g,% 0.1 FA ve santrifüj 500 ul ile sütun dengelenmesi. Flow-through atın ve bu adımı 1x tekrarlayın.
- Peptidin 500 ul kadar ekleme sütun An sindirimi1 dakika boyunca 1.100 xg d santrifüj. Örnek hacmi 500 ul büyükse o zaman bu adımı tekrarlayın.
- 1 dakika boyunca 1100 x g,% 0.1 FA 500 ul ve santrifüj ile sütun yıkayın. Flow-through atın. Bu adım, 1x tekrarlayın.
- 1 dakika boyunca 1.100 xg'de sütun ve santrifüj 90:10 ACN-su oranı 250 ul ekleyin. Tuzsuzlaştınlmış ve peptidleri içeren yıkama sıvısı toplayın ve yeni bir mikrotüp transfer. Bu adım, 1x tekrarlayın.
- Bir vakum santrifüjde tuzu alınmış örnek peptit kurutun ve tamamen kuru numune izin kaçının.
5. İyon Değişimi Kromatografisi
- Peptidlerin ayrılması için bir 200 x 2.1 mm, 5 um SCX kolonu (PolySULPHOETHYL A) üzerine sindirilmiş protein örneğinin 50-100 ug enjekte edilir.
- 250 | il / dk 'lık bir akış oranında 50 dakika zarfında% 2-40 B gradyanı kullanın. Çözücü A 5 mM amonyum format,% 25 asetonitril, pH 3.0 ve% 75 GKD 2 O olduğu Çözücü B 500 mM amonyum format, pH6.0,% 25 ACN ve% 75 GKD 2 O.
- 280 nm'de peptid fraksiyonlarını izlemek ve bir kısım toplayıcısı kullanılarak 2 dakika aralıklarla fraksiyonları toplayın.
- Tuz çıkarılmasına yardımcı% 5 uçucu kül içeren GKD 2 O içinde% 50 asetonitril 500 ul bir vakum yoğunlaştırıcısı ile tekrar süspansiyon Kuru parçacıklar.
- -80 ° C'de Kurutmayınız kesirler ve mağaza nano LC-MS/MS analiz için kullanmaya hazır olana kadar.
6. Aseton Yağış
Önceki GELFrEE ayırma koklear protein yüzer tuz giderme işlemine maruz edilmelidir. Aseton çökelme proteinleri tuzunun giderilmesi ve konsantre kullanılabilir.
- Koklear süpernatana buz soğukluğunda aseton üç sayılarını. Yavaşça girdap ve -20 ° CO / N. inkübe
- 4 ° C'de 15 dakika boyunca 15,000 xg'de santrifüj örnek karışımı ve supernatant çıkarın.
- 4 ° C'de 5 dakika boyunca 14,000 x g soğutulmuş aseton ve santrifüj ile protein topak 3 kez yıkayın° C.
- Pelet hava-kurutun ve 18 M 112 ul su içinde çözülür.
- Mikro kolorimetrik deneyi kullanarak protein konsantrasyonunu belirleyin.
7. Koklear Duyu epiteli GELFrEE Fraksiyonu
- 5x örnek tampon maddesi 30 ul (0.25 M Tris-HCl pH 6.8,% 10 (w / v) SDS,% 50 gliserol,% 0.5 (ağırlık / hacim) bromofenol mavisi) 18 M 112 ul içerisinde süspansiyon haline tuzu giderilmiş proteine su.
- Protein disülfid bağları azaltmak için 5 dakika boyunca 95 ° C 'de 8 ul 1M DTT ve ısıtın. Isıtıldıktan sonra oda sıcaklığına soğumaya bırakılmıştır.
- Anot hazneye akan tampon 8 ml, toplama haznesi örnek çalışan tampon 150 ul ve katot hazneye akan tampon içinde 6 ml ilave edilir.
- Bir pipet kullanılarak, örnek yükleme odasına akan olabilecek tamponunu çıkarın.
- Koklear protein karışımının yük 150 ul (≤ 1 mg), numune yükleme odasına% 8 ile Tr3,5-150 kDa'lık bir kütle aralığı ile kartuş asetattır.
- Çalışmasını başlatmak için alt elektrotlar ve yakın enstrüman kapak.
- Cihaz üzerinde ilk duraklatılmış anda katot rezervuara akan tampon 2 ml ekleyin ve çalıştırmak devam.
- Cihazın her durdurulmuş aralıkta, bir pipet kullanılarak, örnek toplama odasından numunenin toplanması ve taze etiketli mikrotüp ekleyin. Çalışan tampon 150 ul ile toplama haznesi 2x yıkayın ve atın.
- Örnek toplama haznesine taze çalışan tampon 150 ul ekleyin ve çalıştırmak devam. 150 ul / fraksiyonunun toplam hacim içinde 2.6 saatlik bir süre boyunca protein fraksiyonları toplayın.
8. GELFrEE Kesirler 1D Jel Elektroforez
1D jel elektroforezi önce enzimatik sindirme ve MS analizine GELFrEE paya ayırma sonuçlarını görselleştirmek için kullanılabilmektedir. GELFrEE protein parçaları, bir% 4-15 Tris-HCI jeli üzerinde ayrılabilir.
9. FASP kullanma GELFrEE Kesirler Protein Sindirim
Değiştirilmiş bir FASP prosedür GELFrEE fraksiyonların deterjan çıkarılması ve sindirim için kullanılır.
- 8 M Tris-HCI, üre ve 25 dakika boyunca 14,000 xg'de santrifüj 200 ul ile karıştırın, doğrudan 30K filtre ünitesi için her bir fraksiyon ekleyin.
- Üre çözeltisi 200 ul konsantre seyreltinve 12 dakika boyunca 14.000 xg santrifüj. Bu adım, 1x tekrarlayın.
- Her bir filtre ünitesi, 1 dakika süre ile girdap konsantreye üre çözelti içinde 10x IAA 10 ul ekleyin ve karanlıkta, oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edilir.
- 15 dakika boyunca 14,000 x g'de filtre birimleri ve santrifüj üzerindeki konsantresine üre çözeltisi 100 ul ekleyin. Bu adım 2x tekrarlayın. Filtre birimler ve 10 dakika boyunca 14,000 x g'de santrifüj ile 100 mM ABC çözeltisi 100 ul ekleyin. Bu adım 2x tekrarlayın.
- Filtre birimlere bir 1:50 (w / w), enzim için protein oranı için lysC 0.1 ug / ul ilave edin ve 30 ° C'de O / N inkübe
- İnkübasyondan sonra, 10 dakika boyunca 14,000 xg'de santrifüj filtre ve santrifüj 100 mM ABC çözeltisi 40 ul ekle. Bu adım, 1x tekrarlayın.
- 10 dakika boyunca 14,000 xg'de santrifüj filtre ve santrifüj 0.5 M NaCl solüsyonu 50 ul ekle. Yeni bir mikrotüp için her sıkma filtresinden lysC peptidleri içeren filtrat aktarın ve trifluoroac ile asitleştirmekasetik asit (TFA).
- 8 M üre, 40 ul spin filtreleri yıkanır, daha sonra 40 ul 18 M, su ile 2 kez yıkanır.
- Eğirme filtresi 50 mM ABC çözeltisi 100 ul 3x yıkayın. Son yıkama bir 1:100 (a / a) enzim için protein oranında tripsin 0.4 ug / ul ekleyin ve 37 ° C sıcaklıkta O / N sonra inkübe
- 10 dakika boyunca 14,000 x g'de 50 mM ABC çözeltisi ve santrifüj içinde 40 ul eklenmesi ile her bir filtre biriminden triptik peptidlerin elüsyonu. Bu adım, 1x tekrarlayın.
- Filtre birimler ve 10 dakika boyunca 14,000 xg'de santrifüj 0.5 M NaCl solüsyonu 50 ul ekle. Yeni bir mikrotüp, her bir filtre biriminden triptik peptitler içeren filtrat aktarın ve TFA ile asitlenir.
- Vakumlu bir deriştirme aygıtı içinde, tüm digests kurutun.
10. LC-MS/MS için Numune Hazırlama
- Sulandırın kurutuldu lysC ve triptik peptid,% 0.1 FA ve vorteks 20 ul fraksiyonlar sindirir.
- 10 için 20.000 xg Santrifüj örnekleridakika ve yeni bir numune şişesine numunesinin üst% 95 çıkarın.
- Tuzları ve kirlilikleri uzaklaştırmak ve bir 75 um x 10 cm C18 kolonu üzerinde kromatografik ayırma gerçekleştirmek için bir 100 um x 25 mm numune tutucu üzerine her bir peptid fraksiyonu 5 ul enjekte edilir.
- 200 nl / dak 'lık bir debi ile 100 dakika boyunca% 2-40 B gradyanı kullanın. Çözücü A% 95 ddH2O ve% 0.1 FA içeren% 5 asetonitrildir. Çözücü B% 80 ACN ve% 0.1 FA ihtiva eden% 20 ddH2O olduğunu.
- Her MS yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi ile taramak için on tandem kütle spektrumları toplayın. Bir LTQ Orbitrap kütle spektrometresi, bu deneyde kullanıldı.
11. Protein Tanımlama
- Hem ileri içeren UniProt fare veritabanı kullanarak proteinleri tespit ve protein dizileri ve ortak kirletici ters. MASCOT arama motoru ile MaxQuant yazılım protein veritabanı aramak için kullanılır.
- Kullanılabilen ara parametreler; sabit modificsistein carbamidomethyl ation of metioninin oksidasyon değişken modifikasyonlar protein N-terminal asetilasyonu, 2 en fazla bölünmesini cevapsız. Tanımlanması için dikkate alınması gereken minimum peptid uzunluğu 6 amino asit kadardır. ± 8 ppm ve 1.2 Da (kütle hata kütle spektrometresi kullanılan bağlıdır) bir parçası kitlesel bir hoşgörü peptid kütle konsantrasyonu hatayı girin.
- MaxQuant yazılım, peptid ve protein belirlenmesi için bir% 1 yanlış keşif hızı (FDR) kullanın. Protein tespiti eşleşen peptidler, yüzde protein sekansı içerisinde, ve peptid dizilerinin sayısı ile listelenir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Koklear duyu epiteli en kapsamlı proteomesini edinmek için, hızlı doku diseksiyonu öncesi protein ekstraksiyon ve numune hazırlama için gereklidir. İki proteomik teknikleri, av tüfeği ve aşağıdan yukarıya proteomiks kullanılabilir. Şekil 1 'de gösterildiği gibi av tüfeği proteomik için numune hazırlamak için, FASP sindirim prosedür kullanıldı. FASP yöntem, protein konsantrasyonu, deterjan ortadan kaldırılması, ve birden fazla enzimleri kullanılarak protein sindirimi için olanak sağlar. İlk bir araya getirilmiş, 18 fraksiyonlar bir SCX sütunu üzerinde fraksiyonlarına ayrılmış ve nano LC-MS/MS ile analiz edildi tripsin ile ikinci sindirme ile ve ardından bir triptik sindirim olduğu kullanılan iki çift sindirim işlemleri vardı. Bu deneysel yaklaşımı kullanarak bir tek çalıştırmak LC-MS/MS yaparken 1.485 proteinlerin toplam% 1 FDR ile tespit edilmiştir. Belirlenen proteinler arasında, 329 ve 258 proteinler (sırasıyla Şekil, mitokondri ve plazma membranında kategorize edildi2A). İkinci çift sindirim prosedür şekilde tripsin emdirme ile, ardından lysC sindirim oluşuyordu. Her bir özeti ayrı yüklenir ve SCX kolonu üzerinde ayrılır 18 bölüme ve nano LC-MS/MS ile analiz edildi. LysC ve tripsin sindirimler sonuçları, bir% 1 FDR. Şekil 2B'de ile 3503 proteinlerin toplam üretilen 605 ve 617 proteinler, sırasıyla, mitokondri ve plazma membranında kategorize olduğunu göstermektedir. Bu yaklaşım, zara bağlı protein kimliklerinin en büyük sayı sağladı. LysC ve tripsin fraksiyonların yinelenen analiz ile, proteinlerin fazla% 65 deneyler arasında paylaşıldı gösterdi. Bununla birlikte, suret analizinde yeni tanımlanan proteinler de vardı. Ek peptidler ve proteinler dolayısıyla parçalanma 25 için farklı peptidlere yol nedeniyle kromatografi küçük değişiklikler tespit edilmiştir.
Aşağıdan yukarıya proteomiks GELFrEE parçalaması kullanılarak uygulandıŞekil 3'te gösterildiği gibi, LC-MS/MS önce. Toplanan 12 GELFrEE fraksiyonlar vardı. Önceki sindirim ve LC-MS/MS analizine, gümüş-lekeli jel, Şekil 4'te gösterildiği gibi GELFrEE paya ayırma sonuçlarını görselleştirmek için hazırlanmıştır. Jel, her bir ardışık kısmı için molekül ağırlığı arttırılarak protein ayırma gösterdi. Bu nedenle, 12 GELFrEE sıvı parçacıklar, iki farklı çok-FASP sindirim yaklaşımlar kullanılarak sindirilmiş ve LC-MS/MS ile analiz edildi. İlk sindirim yaklaşım tek-run LC-MS/MS yaparken% 1 FDR ile 2.165 proteinlerin tanımlanmasına yol açan bir çift tripsin sindirim kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Şekil 5A gösterir orada 516 ve 399 proteinler mitokondri kategorize olduğunu ve plazma membranı, sırasıyla. İkinci yaklaşım, sindirim şekilde tripsin emdirme ile, ardından endoproteinaz lysC kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Tek-run LC-MS/MS analizi% 1 FDR ile 2211 proteinleri tespit. Buyaklaşım tripsin / tripsin yaklaşımı (Şekil 5B) ile olduğu gibi zara bağlı proteinlerin benzer sayıda göstermiştir. Kütle spektrometresi proteomiks veri veri seti tanımlayıcı PXD000231 25 ProteomeXchange Konsorsiyumu 26 yatırılır edilmiştir. Farklı teknikler elde edilen sonuçlar, fare koklea duyusal epitel (Şekil 6) gelen membran ve çözünebilir proteinlerin bir çok sayıda sonuçlandı birleştirilmesi.
Şekil 1. FASP, iyon değişim kromatografisi ve yüksek çözünürlüklü MS kullanılarak bir tüfek proteomik deneyinin şematik. Proteinler, çözünür ekstre edilmiş ve lysC ve tripsin ile endoproteinaz FASP ile sindirilir. IvsC'deki (yeşil tüp) ve triptik peptidler (mor tube) SCX kromatografisi kullanılarak daha az karmaşık bir fraksiyon halinde ayrılır ve nano LC-MS/MS ile analiz edilmiştir. MASCOT arama motoru protein tanımlanması için MS verilerini işlemek için kullanıldı. resmi büyütmek için buraya tıklayın.
SCX ayırma ve SCX ayırma, ardından tripsin ile ikinci sindirme ile ve ardından lysC ile (B) ilk, ardından tripsin ile sindirme ile (A) birinci ve ikinci sindirim yaparken Şekil 2,. Protein kimliklerinin hücre bileşenleri profil GO. Tüm kategoriler sayılır arasında sınırlandırıcı olmamak üzere, bir protein, hücresel bileşenler için birden fazla kategori olduğunda.es.jpg "target =" _blank "> büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın.
Şekil 3. GELFrEE, FASP ve yüksek çözünürlüklü MS kullanılarak aşağıdan yukarıya proteomik deneyinin şematik. Çıkarılan proteinler çözeltileştirildi ve proteinler lizattan tuzları ve istenmeyen kirleri çıkarmak için aseton (mavi tüp) kullanılarak çöktürülür. Protein topağı çözündürülmüş ve proteinler GELFrEE kullanılarak parçalandı. Her bir fraksiyon lysC ve tripsin ile endoproteinaz FASP kullanılarak sindirilmiştir. IvsC'deki Her fraksiyonun MASCOT kullanarak MS verilerini arayarak tespit nano LC-MS/MS ve proteinleri kullanılarak analiz edilmektedir dan (yeşil tüpler) ve triptik peptidler (mor tüpler). büyük görüntülemek için buraya tıklayın r görüntü.
Şekil 4. Önce MS analizi için, her kısıma protein ayırma görselleştirmek için koklear duyusal epitel GELFrEE kısımların, gümüş-lekeli jeli. (M) Protein etiketi, (1) Fraksiyon 1, (3) Fraksiyon 2, (5) fraksiyon 5 (7), 7 fraksiyonu, (8) Kesir 8, (9) Kesir 9, (10) Fraksiyon 10, (11) Fraksiyon 11, (12) Fraksiyon 12. Darville ve Sokolowski 24 izniyle (uyarlanmış) yayımlanmaktadır. American Chemical Society tarafından telif hakkı 2013. resmi büyütmek için buraya tıklayın.
/ Files/ftp_upload/51186/51186fig5.jpg "/>
Şekil 5,. GELFrEE ayırma ve GELFrEE ayrıldıktan sonra tripsin ile ikinci sindirme ile ve ardından lysC ile (B) ilk sindirim sonra tripsin ile birinci ve ikinci sindirim, (A) gerçekleştirirken protein kimliklerinin hücre bileşenleri profil GO. Tüm kategoriler arasında sınırlandırıcı olmamak üzere sayılır, bir protein hücresel bileşenler için birden fazla kategori olduğunda. resmi büyütmek için buraya tıklayın.
Şekil 6,. SCX, WAX, veya GELFrEE ayırma kullanarak belirlenen tüm proteinlerin hücresel bileşenleri profili GO. Bir protein hücresel bileşenler için birden fazla kategori, kendi kategoride tüm vardıs nonexclusively sayıldı. resmi büyütmek için buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Koklear duyu epitel protein kimlik maksimize önemli adımlar şunlardır: sindirim için birden endoproteinazlara 1) kullanımı, birden fazla ayırma teknikleri 2) kullanımı ve yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi 3) kullanımı. Birden enzimlerin uygulanması peptidlerin sayısını arttırır ve protein dizisi kapsama geliştirir, bu nedenle koklear dokudan belirlenen protein sayısını artırır. Tripsin, en yaygın olarak kullanılan proteaz MS iyonlaşma ve parçalanması için iyi olan peptidler üreten, proteinlerin verimli ve belirli bölünme sağlar. Ancak, bu daha etkili peptid bölünmesini içerir lisin çökeltisinde da böler, lysC olarak önce tripsin için başka bir enzim kullanılarak. Bu lysC / tripsin sindirim üretilen proteinin sekans kapsamı tripsin / tripsin hazmından protein sekansı içerisinde protein sekansı kapsama orantılı olarak artış gösterdiği gözlemlenmiştir.
"ove_content> önce MS boyutlu ayırma Uygulama tüfek proteomik yaklaşımda yüksek koklear örnek azaltılmış karmaşıklık. bu tespit etmek genelde zordur zar proteinleri de dahil olmak üzere daha fazla protein, tanımlanması için izin verdi. zar proteinlerinin daha büyük bir dizi kullanılarak belirlendi aşağıdan yukarıya yaklaşımın aksine av tüfeği yaklaşım. Ancak, daha düşük bol proteinlerin belirlenmesi için izin GELFrEE kullanarak aşağıdan yukarıya yaklaşım. Bu tür kokleadan bireysel içine Cochlin gibi yüksek bol proteinlerin izolasyonu nedeniyle kesirler.Böyle bir LTQ-Orbitrap, geliştirir ve kokleadaki tespit edilebilir proteinlerin sayısını artırır gibi bir yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi tarafından mevcut protokolde elde yüksek kalitede veri. LTQ-Orbitrap yüksek çözünürlük, yüksek kütle doğruluğu ve peptidlerin analizi için yüksek hassasiyet sunar. Bu alet İAB of Bu nedenle, uygulamales gibi koklear duyusal epitel gibi kompleks biyolojik örnekler, proteinlerin tanımlanması ve düşük bol peptitlerin tanımlanmasını artırır. MS güçlü bir araç ile bu kombine deneysel yaklaşımlardan yararlanması önemli ölçüde bu nedenle işitme ve sağırlık katılan yeni protein Biyobelirteçleri tanımlamak için fırsat iyileştirilmesi, koklear protein dataset artırmak için yardımcı olur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan ederim.
Acknowledgments
Yazarlar Dr Kent Seeley, bu tesisin kullanımı için Güney Florida Üniversitesi İlaç Keşif ve Yenilik Merkezi (CDDI) Proteomiks Çekirdek Tesis Direktörü teşekkür ederim. Bu çalışma Bhas NIH / NIDCD hibe R01 DC004295 tarafından desteklenen
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8% Tris-acetate cartridge | Protein Discovery | 42103 | |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | |
| Acetonitrile | Honeywell | 015-1L | |
| AEBSF | Calbiochem | 101500 | |
| Ammonium formate | Fisher Scientific | AC16861 | |
| Aprotinin | Calbiochem | 616370 | |
| ASB-14 | Calbiochem | 182750-5GM | |
| Bovine serum albumin | BioRad | 500-0112 | |
| C18 column | New Objective | A25112 | 75 μm x 10 cm |
| DC Protein Assay | BioRad | 500-0116 | Microplate Assay Protocol |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| Endoproteinase Lys-C | Sigma-Aldrich | P3428 | |
| FASP Protein Digestion Kit | Protein Discovery | 44250 | |
| Formic acid | Fluka | 94318 | |
| GELFrEE Fractionation System | Protein Discovery | 42001 | GELFrEE 8100 |
| Leupeptin | Calbiochem | 108975 | |
| MacroSpin Column | The Nest Group | SMM SS18V | Silica C18 |
| Microcystin | Calbiochem | 475815 | |
| Pepstatin | Sigma-Aldrich | P5318 | |
| Polysulfoethyl A Column | The Nest Group | 202SE0503 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Sonic Dismembrator | Thermo Fisher | 15-338-53 | Model 100 |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T6567 | Proteomics Grade |
References
- Domon, B., Aebersold, R. Review - Mass spectrometry and protein analysis. Science. 312, 212-217 (2006).
- Jamesdaniel, S., Hu, B., Kermany, M. H., Jiang, H., Ding, D., Coling, D., Salvi, R. Noise induced changes in the expression of p38/MAPK signaling proteins in the sensory epithelium of the inner ear. J. Proteomics. 75, 410-424 (2011).
- Thalmann, I., Hughes, I., Tong, B. D., Ornitz, D. M., Thalmann, R. Microscale analysis of proteins in inner ear tissues and fluids with emphasis on endolymphatic sac, otoconia, and organ of Corti. Electrophoresis. 27, 1598-1608 (2006).
- Thalmann, I., Rosenthal, H. L., Moore, B. W., Thalmann, R. Organ of Corti-specific polypeptides: OCP-I and OCP-II. J. Acoust. Soc. Am. 67, (1980).
- Kathiresan, T., Harvey, M., Sokolowski, B. The use of two-dimensional gels to identify novel protein-protein interactions in the cochlea. In Auditory and vestibular research : methods and protocols. , Humana ; Springer. New York, N.Y. (2009).
- Zheng, Q. Y., Rozanas, C. R., Thalmann, I., Chance, M. R., Alagramam, K. N. Inner ear proteomics of mouse models for deafness, a discovery strategy. Brain Res. 1091, 113-121 (2006).
- Peng, H., Liu, M., Pecka, J., Beisel, K. W., Ding, S. J. Proteomic Analysis of the Organ of Corti Using Nanoscale Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry. Int. J. Mol. Sci. 13, 8171-8188 (2012).
- Elkan-Miller, T., Ulitsky, I., Hertzano, R., Rudnicki, A., Dror, A. A., Lenz, D. R., Elkon, R., Irmler, M., Beckers, J., Shamir, R., Avraham, K. B. Integration of Transcriptomics, Proteomics, and MicroRNA Analyses Reveals Novel MicroRNA Regulation of Targets in the Mammalian Inner Ear. Plos One. 6, (2011).
- Yang, Y., Dai, M., Wilson, T. M., Omelchenko, I., Klimek, J. E., Wilmarth, P. A., David, L. L., Nuttall, A. L., Gillespie, P. G., Shi, X. Na+/K+-ATPase α1Identified as an Abundant Protein in the Blood-Labyrinth Barrier That Plays an Essential Role in the Barrier Integrity. Plos One. 6, (2011).
- Shin, J. B., Streijger, F., Beynon, A., Peters, T., Gadzala, L., McMillen, D., Bystrom, C., Vander Zee, C. E., Wallimann, T., Gillespie, P. G. Hair Bundles Are Specialized for ATP Delivery via Creatine Kinase. Neuron. 53, 371-386 (2007).
- Chen, Z. Y., Corey, D. P. An inner ear gene expression database. J. Assoc. Res. Otolaryngol. 3, 140-148 (2002).
- Gabashvili, I. S., Sokolowski, B. H., Morton, C. C., Giersch, A. B. Ion channel gene expression in the inner ear. J. Assoc. Res. Otolaryngol. 8, 305-328 (2007).
- Horvatovich, P., Hoekman, B., Govorukhina, N., Bischoff, R. Multidimensional chromatography coupled to mass spectrometry in analysing complex proteomics samples. J. Sep. Sci. 33, 1421-1437 (2010).
- Ye, M. L., Jiang, X. G., Feng, S., Tian, R. J., Zou, H. F. Advances in chromatographic techniques and methods in shotgun proteome analysis. Trends Anal. Chem. 26, 80-84 (2007).
- Wu, C. C., MacCoss, M. J. Shotgun proteomics: Tools for the analysis of complex biological systems. Curr. Opin. Mol. Ther. 4, 242-250 (2002).
- Bora, A., Anderson, C., Bachani, M., Nath, A., Cotter, R. J. Robust Two-Dimensional Separation of Intact Proteins for Bottom-Up Tandem Mass Spectrometry of the Human CSF Proteome. J. Proteome Res. 11, 3143-3149 (2012).
- Chait, B. T. Mass spectrometry: Bottom-up or top-down. Science. 314, 65-66 (2006).
- Aebersold, R., Mann, M.
- Reid, G. E., McLuckey, S. A. Top down' protein characterization via tandem mass spectrometry. J. Mass. Spectrom. 37, 663-675 (2002).
- Han, X., Aslanian, A., Yates, J. R.
- Thalmann, I. Inner ear proteomics: A fad or hear to stay. Brain Res. 1091, 103-112 (2006).
- Lang, F., Vallon, V., Knipper, M., Wangemann, P. Functional significance of channels and transporters expressed in the inner ear and kidney. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 293, (2007).
- Wisniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nat. Meth. 6, 359-362 (2009).
- Wisniewski, J. R., Zielinska, D. F., Mann, M. Comparison of ultrafiltration units for proteomic and N-glycoproteomic analysis by the filter-aided sample preparation method. Anal. Biochem. 410, 307-309 (2011).
- Darville, L. N., Sokolowski, B. H. In-depth Proteomic Analysis of Mouse Cochlear Sensory Epithelium by Mass Spectrometry. J Proteome Res. 12 (8), 3620-3630 (2013).
- Vizcaino, J. A., Cote, R. G., Csordas, A., Dianes, J. A., Fabregat, A., Foster, J. M., Griss, J., Alpi, E., Birim, M., Contell, J., O'Kelly, G., Schoenegger, A., Ovelleiro, D., Perez-Riverol, Y., Reisinger, F., Rios, D., Wang, R., Hermjakob, H. The PRoteomics IDEntifications (PRIDE) database and associated tools: status in 2013. Nucleic Acids Res. 41, 1063-1069 (2013).
