مراقبة المنافسة داخل الأنواع في مجموعة الخلايا البكتيرية عن طريق Cocultivation من السلالات المسمى Fluorescently

Summary

البكتيريا قد تتراكم إما الطفرات الضارة أو المفيدة خلال حياتهم. في مجموعة من الخلايا الأفراد التي تراكمت الطفرات المفيدة قد تفوق بسرعة زملائهم. هنا نقدم إجراء بسيط لتصور المنافسة داخل الأنواع في مجموعة خلايا بكتيرية مع مرور الوقت باستخدام الأفراد المسمى fluorescently.

Abstract

العديد من الكائنات الحية الدقيقة مثل البكتيريا تتكاثر بسرعة كبيرة والسكان قد تصل إلى كثافات الخلايا العالية. الكسور الصغيرة من الخلايا في السكان لديها دائما الطفرات المتراكمة التي هي إما ضارة أو مفيدة للخلية. إذا كان تأثير اللياقة البدنية للطفرة يوفر للزم السكان الفرعيين ميزة نمو انتقائية قوية ، فقد يتفوق أفراد هذه الاكتظاظ السكاني الفرعي بسرعة وحتى القضاء التام على زملائهم المباشرين. وهكذا، فإن التغيرات الجينية الصغيرة والتراكم القائم على الاختيار للخلايا التي اكتسبت طفرات مفيدة قد يؤدي إلى تحول كامل في النمط الجيني لخلايا المجموعة. هنا نقدم إجراء لرصد التوسع اللاستنساخي السريع والقضاء على الطفرات المفيدة والضارة ، على التوالي ، في مجموعة الخلايا البكتيرية مع مرور الوقت عن طريق cocultivation من الأفراد المسمى فلوريا من البكتيريا نموذج إيجابي غرام عصيات subtilis. طريقة سهلة الأداء وتوضيحية جدا لعرض المنافسة داخل الأنواع بين الأفراد في مجموعة خلايا بكتيرية.

Introduction

وعادة ما تكون بكتيريا التربة مزودة بشبكات تنظيمية مرنة وقدرات استقلابية واسعة. كلا الميزتين تمكن الخلايا لضبط مساراتها تقويضي والابتنائية للتنافس مع زملائهم والكائنات الحية الدقيقة الأخرى للمغذيات, التي تتوفر في مكانة بيئية معينة¹. ومع ذلك ، إذا كانت البكتيريا غير قادرة على التكيف مع بيئتها آليات أخرى قد تفسر بقاء الأنواع. في الواقع، كما العديد من البكتيريا تتكاثر بسرعة والسكان يمكن أن تصل إلى كثافة الخلايا العالية التجمعات السكانية الفرعية قد تراكمت تلقائيا الطفرات المفيدة التي توفر للخلايا مع ميزة النمو الانتقائي، وبالتالي زيادة لياقتهم البدنية. وعلاوة على ذلك، يمكن أن النقاط الساخنة الطفرة وطفرات التكيف الناجمة عن الإجهاد تسهيل تطور بكتيريا غير معدلة^2،3. وهكذا، فإن تراكم الطفرات والنمو في ظل الاختيار المستمر هو أصل التنوع الميكروبي الهائل، حتى داخل نفس الجنس^4،5. كما هو الحال في الطبيعة ، فإن تشكيل الجينوم البكتيري يحدث أيضا في المختبر بسبب الزراعة المستمرة قيد الاختيار. ويتجلى ذلك في تدجين البكتيريا الفرعية B. إيجابية الغرام، والتي تستخدم في جميع أنحاء العالم في البحوث الأساسية وفي الصناعة. في 1940s B. تم التعامل مع subtilis الحمض النووي الضارة الأشعة السينية تليها زراعة تحت شرط نمو محدد⁶. الطفرات التي تراكمت في البكتيريا خلال تدجينها مسؤولة عن فقدان العديد من خصائص النمو ، أي سلالة مختبر B. subtilis 168 فقدت القدرة على تشكيل مستعمرات معقدة^7،8.

في الوقت الحاضر، لأفضل دراسة نموذج البكتيريا Escherichia القولونية وB. subtilis، مجموعة متنوعة من الأدوات القوية المتاحة للتلاعب وراثيا الجينوم من أجل معالجة مسائل علمية محددة. في بعض الأحيان يسبب تعطيل جين الفائدة عيبا حادا في النمو ، والذي يظهر بوضوح على متوسط النمو القياسي^9. وعلى النقيض من ذلك، غالبا ما يتم تجاهل الطفرات التي تسبب عيبا ضعيفا في النمو وبالتالي تؤثر بشكل طفيف على لياقة السلالة. ومع ذلك ، في كلتا الحالتين الحضانة المطولة و passaging من سلالات متحولة لعدة أجيال وعادة ما يؤدي إلى تراكم المسوخ القامع التي استعادت النمط الظاهري للسلالة الأم^2،9. إن توصيف المسوخ القامعة وتحديد الطفرات التي أعادت عيب نمو السلالة المتحولة الأم هو نهج مفيد للغاية يسمح بجلاء العمليات الخلوية الهامة والجديدة في كثير من الأحيان^10،11.

نحن مهتمون في السيطرة على التوازن الغلوتامات في B. subtilis¹². على غرار الإشريكية القولونية، يستجيب B. subtilis لاثارة الغلوتامات التوازن(أيكتلة في تدهور الغلوتامات²⁾من خلال تراكم المسوخ القامعة. وتبين أن التعديلات الجينومية في هذه المسوخ القامعة التي تم الحصول عليها عن طريق طفرة عفوية لاستعادة الغلوتامات التوازن^{بسرعة 9,13}. لذلك ، ليس من المستغرب أن التكيف مع B. subtilis إلى حالة نمو محددة أثناء تدجين البكتيريا ينعكس في تخليق الإنزيم وفي الأنشطة الأنزيمية المتطورة ، والتي تشارك في استقلاب الغلوتامات¹². وقد اقترح أن عدم وجود الغلوتامات الخارجية في المتوسط النمو خلال عملية التدجين كان القوة الدافعة لظهور تثبيت خفي الغلوتامات ديهيدروجيناز (GDH) gudB^CR الجينات في سلالة المختبر 168^2,14. ويدعم هذه الفرضية ملاحظتنا أن انخفاض كمية نشاط GDH في سلالة المختبر يوفر البكتيريا مع ميزة النمو الانتقائي عندما الغلوتامات الخارجية نادرة². وعلاوة على ذلك، فإن زراعة سلالة B. subtilis، توليف GDH GudB، في غياب الغلوتامات الخارجية يؤدي إلى تراكم المسوخ القامعة التي أدت إلى تعطيل الجين gudB ². من الواضح أن وجود GDH نشط تقويضيا غير مؤات للخلية لأن الغلوتامات المنتجة داخليا التي يمكن استخدامها لولا ذلك للتأيض تتحلل إلى الأمونيوم و 2-oxoglutarate (الشكل 1). وعلى النقيض من ذلك، عندما يتم توفير الغلوتامات عن طريق الوسط، فإن سلالة B. subtilis المجهزة بنشاط GDH عالي المستوى لها ميزة نمو انتقائية على سلالة تجمع GDH وظيفية واحدة فقط. من المعقول افتراض أن نشاط GDH عالي المستوى يسمح للبكتيريا باستخدام الغلوتامات كمصدر كربون ثان بالإضافة إلى مصادر الكربون الأخرى التي يوفرها الوسيط² (انظر الشكل 1). وبالتالي، يؤثر نشاط GDH بقوة على لياقة البكتيريا، اعتمادا على توافر الغلوتامات الخارجية.

هنا نقدم طريقة توضيحية جدا لرصد وتصور المنافسة داخل الأنواع بين اثنين من سلالات subtilis B. التي تختلف في مكان واحد على الكروموسوم(الشكل 2). وصفت سلالات اثنين مع الجينات yfp وcfp ترميز YFP الفلوروفوريس وCFP، و cocultivated في ظل ظروف غذائية مختلفة. عن طريق أخذ العينات مع مرور الوقت والطلاء المخففات المناسبة على لوحات أجار يمكن رصد الناجين في كل من الثقافات بسهولة باستخدام المجهر مضان ستيريو المشتركة. الإجراء الموصوف في هذه الورقة سهل الأداء ومناسب لتصور التوسع اللاستنساخي السريع والقضاء على الطفرات المفيدة والضارة ، على التوالي ، في مجموعة خلايا بمرور الوقت.

Protocol

1. إعداد لوحات أجار، وسائل الإعلام الثقافية، Cryostocks، والثقافات المسبقة إعداد وسائط النمو والكواشف المطلوبة (انظر جدول المواد والكواشف). خط سلالات B. subtilis (على سبيل المثال. BP40 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-yfp) و BP52 (rocG+ gudB+ amyE::Pgud…

Representative Results

تم تطبيق الطريقة الموصوفة هنا بنجاح لتصور المنافسة داخل الأنواع في مجموعة خلايا تتكون من سلالات B. subtilis التي تم تصنيفها بجينات cfp و yfp لترميز الفلوروفوريس CFP و YFP ، على التوالي. كما هو مبين في الشكل 3، يمكن استخدام هذه الطريقة لتصور المنافسة داخل الأنواع بطريقة توضيحية…

Discussion

وقد وضعت عدة طرق لتحليل اللياقة التنافسية للبكتيريا¹⁶. في كثير من الحالات وصفت البكتيريا مع أشرطة مقاومة المضادات الحيوية المختلفة¹⁷. على غرار نهجنا ، فإن وضع العلامات على الخلايا باستخدام أشرطة مقاومة المضادات الحيوية يسمح بتقييم اللياقة التنافسية للبكتيريا أثناء cocultivation في ?…

Materials

(NH4)2SO4	Roth, Germany	3746	–
Agar	Difco, USA	214010	–
Ammonium ferric citrate (CAF)	Sigma-Aldrich, Germany	9714	–
CaCl2	Roth, Germany	5239	–
Glucose	Applichem, Germany	A3617	–
Glycerol	Roth, Germany	4043	–
K2HPO4 x 3 H2O	Roth, Germany	6878	–
KCl	Applichem, Germany	A3582	–
KH2PO4	Roth, Germany	3904	–
KOH	Roth, Germany	6751	–
MgSO4 x 7 H2O	Roth, Germany	P027	–
MnCl2	Roth, Germany	T881	–
MnSO4 x 4 H2O	Merck Millipore, Germany	102786	–
NaCl	Roth, Germany	9265	–
Nutrient broth	Roth, Germany	X929	–
Potassium glutamate	Applichem, Germany	A3712	–
Tryptone	Roth, Germany	8952	–
Tryptophan	Applichem, Germany	A3445	–
Yeast extract	Roth, Germany	2363	–
1.5 ml Reaction tubes	Sarstedt, Germany	72,690,001	–
2.0 ml Reaction tubes	Sarstedt, Germany	72,691	–
15 ml Plastic tubes with screw cap	Sarstedt, Germany	62,554,001	–
Petri dishes	Sarstedt, Germany	82.1473	–
1.5 ml Polystyrene cuvettes	Sarstedt, Germany	67,742	–
15 ml Glass culture tubes	Brand, Germany	7790 22	–
with aluminium caps
100 ml Shake flasks with aluminium caps	Brand, Germany	928 24	–
Sterile 10 ml glass pipettes	Brand, Germany	278 23	–
Incubator (28 and 37 °C)	New Brunswick	M1282-0012	–
Standard pipette set (2-20 μl, 10-100 μl, 100-1000 μl)	Eppendorf, Germany	4910 000.034, 4910 000.042,	–
		4910 000.042,
		4910 000.069
Table top centrifuge for 1.5 and 2 ml reaction tubes	Thermo Scientific, Heraeus Fresco 21, Germany	75002425	–
Table top centrifuge for 15 ml plastic tubes	Heraeus Biofuge Primo R, Germany	75005440	–
Standard spectrophotometer	Amersham Biosciences Ultrospec 2100 pro, Germany	80-2112-21	–
Stereofluorescence microscope	Zeiss SteREO Lumar V12, Germany	495008-0009-000	–
Freezer (-20 and -80 °C)	–	–	–
Fridge (4 °C)	–	–	–
Autoclave	Zirbus, LTA 2x3x4, Germany	–	–
pH meter	pH-meter 766, Calimatic, Knick, Germany	766	–
Vortex	Vortex  3, IKA, Germany	3340000	–
Balance	CP2202S, Sartorius, Germany	replaced by	–
		CPA2202S
Black pen (permanent marker)	Staedler, Germany	317-9	–
Powerpoint program	Microsoft, USA	–	–
Office Excel program	Microsoft, USA	–	Program for data processing
Adobe Photoshop CS5	Adobe, USA	replaced by CS6, download	Computer program for image processing
Computer	PC or Mac	–	–
ZEN pro 2011 software for the stereofluorescence microscope	Zeiss, Germany	410135 1002 110	AxioCam MRc Rev. Obtained through Zeiss
Specific solution recipes
SP medium
8 g Nutrient broth
0.25 mg MgSO4 x 7 H2O
1 g KCl
if required, add 15 g agar for solid SP medium
ad 1 l with H2O, autoclave for 20 min at 121 °C
1 ml CaCl2 (0.5 M), sterilized by filtration
1 ml MnCl2 (10 mM) sterilized by filtration
2 ml ammonium ferric citrate (CAF, 2.2 mg/ml), sterilized by filtration
LB medium
10 g Tryptone
5 g Yeast extract
10 g NaCl
if required, add 15 g agar for solid LB medium
ad 1 l with H2O, autoclave for 20 min at 121 °C
C-Glc minimal medium
200 ml 5 x C salts
10 ml L-Tryptophan (5 mg/ml), sterilized by filtration
10 ml ammonium ferric citrate (CAF, 2.2 mg/ml), sterilized by filtration
10 ml III’ salts
25 ml Glucose (20%), autoclaved for 20 min at 121 °C
ad 1 l with sterile H2O
CE-Glc minimal medium
200 ml 5 x C salts
10 ml L-Tryptophan (5 mg/ml), sterilized by filtration
10 ml ammonium ferric citrate (CAF, 2.2 mg/ml), sterilized by filtration
10 ml III’ salts
20 ml Glutamate (40%)
25 ml Glucose (20%), autoclaved for 20 min at 121 °C
ad 1 l with sterile H2O
5 x C salts
20 g KH2PO4
80 g K2HPO4 x 3 H2O
16.5 g (NH4)2SO4
ad 1 l with sterile H2O, autoclave for 20 min at 121 °C
III’ salts
0.232 g MnSO4 x 4 H2O
12.3 g MgSO4 x 7 H2O
ad 1 l with sterile H2O, autoclave for 20 min at 121 °C
40% Glutamate solution
200 g L-Glutamic acid
adjust the pH to 7.0 by adding approximately 80 g KOH
ad 0.5 l with sterile H2O, autoclave for 20 min at 121 °C
0.9% Saline (NaCl) solution
ad 1 l with sterile H2O, autoclave for 20 min at 121 °C
50% Glycerol solution
295 ml Glycerol (87%)
ad 0.5 l with sterile H2O, autoclave for 20 min at 121 °C
Bacteria (All strains are based on the Bacillus subtilis strain 168)
Bacillus subtilis BP40 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-yfp)			Laboratory strain collection
Bacillus subtilis BP41 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-cfp)
Bacillus subtilis BP52 (rocG+ gudB+ amyE::PgudB-cfp)
Bacillus subtilis BP156 (rocG+ gudB+ amyE::PgudB-yfp)