As bactérias podem acumular mutações prejudiciais ou benéficas durante a vida. Em uma população de células indivíduos que acumularam mutações benéficas podem rapidamente superar seus companheiros. Aqui apresentamos um procedimento simples para visualizar a competição de intraespécies em uma população de células bacterianas ao longo do tempo usando indivíduos rotulados fluorescentes.
Muitos microrganismos, como bactérias, proliferam extremamente rápido e as populações podem atingir altas densidades celulares. Pequenas frações de células em uma população sempre têm mutações acumuladas que são prejudiciais ou benéficas para a célula. Se o efeito fitness de uma mutação fornece a subpopulação com uma forte vantagem de crescimento seletivo, os indivíduos desta subpopulação podem rapidamente superar e até eliminar completamente seus companheiros imediatos. Assim, pequenas alterações genéticas e acúmulo de células que adquiriram mutações benéficas podem levar a uma mudança completa do genótipo de uma população celular. Aqui apresentamos um procedimento para monitorar a rápida expansão clonal e a eliminação de mutações benéficas e prejudiciais, respectivamente, em uma população celular bacteriana ao longo do tempo por cocultivação de indivíduos fluorescentes rotulados da bactéria modelo Gram-positivo Bacillus subtilis. O método é fácil de executar e muito ilustrativo para exibir competição intraespécie entre os indivíduos em uma população celular bacteriana.
As bactérias do solo são geralmente dotadas de redes regulatórias flexíveis e amplas capacidades metabólicas. Ambas as características permitem que as células ajustem suas vias catabólicas e anabólicas para competir com seus companheiros e outros microrganismos pelos nutrientes, que estão disponíveis em um determinado nicho ecológico1. No entanto, se as bactérias não conseguem se adaptar ao seu ambiente, outros mecanismos podem explicar a sobrevivência de uma espécie. De fato, como muitas bactérias se proliferam rapidamente e as populações podem atingir altas densidades celulares, subpopulações podem ter mutações benéficas acumuladas espontaneamente que fornecem às células uma vantagem de crescimento seletiva e, portanto, aumentam sua aptidão. Além disso, hotspots mutacionais e mutagênese adaptativa induzida pelo estresse podem facilitar a evolução de uma bactéria mal adaptada2,3. Assim, o acúmulo de mutações e crescimento sob seleção contínua é a origem da enorme diversidade microbiana, mesmo dentro do mesmo gênero4,5. Como na natureza, a modelagem de genomas bacterianos também ocorre em laboratório devido ao cultivo contínuo em seleção. Isso é exemplificado pela domesticação da bactéria Gram-positive B. subtilis, que é usada mundialmente em pesquisa básica e na indústria. Na década de 1940, a subtilis foi tratada com raios-X prejudiciais ao DNA, seguido pelo cultivo sob uma condição específica de crescimento6. As mutações que se acumularam nas bactérias durante sua domesticação são responsáveis pela perda de muitas características de crescimento, ou seja, a cepa de laboratório B. subtilis 168 perdeu a capacidade de formar colônias complexas7,8.
Hoje em dia, para as bactérias modelo mais bem estudadas Escherichia coli e B. subtilis,uma variedade de ferramentas poderosas está disponível para manipular geneticamente seus genomas a fim de abordar questões científicas específicas. Às vezes, a inativação de um gene de interesse causa um grave defeito de crescimento, que é então claramente visível no meio de crescimento padrão9. Em contraste, mutações que causam um fraco defeito de crescimento e, portanto, apenas afetam ligeiramente o condicionamento físico da cepa são muitas vezes ignoradas. No entanto, em ambos os casos a incubação prolongada e a passagem das cepas mutantes por várias gerações geralmente resultam no acúmulo de mutantes supressores que restauraram o fenótipo da cepa dos pais2,9. A caracterização dos mutantes supressores e a identificação das mutações que restauraram o defeito de crescimento da cepa mutante dos pais é uma abordagem muito útil que permite a elucidação de processos celulares importantes e muitas vezes novos10,11.
Estamos interessados no controle da homeostase glutamato em B. subtilis12. Semelhante a E. coli, B. subtilis responde à perturbação da homeostase glutamato (ou seja,bloco na degradação do glutamato2) pelo acúmulo de mutantes supressores. As alterações genômicas nesses mutantes supressores que foram adquiridos por mutação espontânea foram demonstradas para restaurar rapidamente a homeostase glutamato9,13. Portanto, não é de surpreender que a adaptação de B. subtilis a uma condição específica de crescimento durante a domesticação da bactéria seja espelhada na síntese enzimática e nas atividades enzimáticas evoluídas, que estão envolvidas no metabolismo do glutamato12. Tem sido sugerido que a falta de glutamato exógeno no meio de crescimento durante o processo de domesticação foi a força motriz para o surgimento e fixação do gene dehidroase de glutamato enigmático (GDH) gudBCR na cepa laboratorial 1682,14. Esta hipótese é apoiada pela nossa observação de que a quantidade reduzida de atividade de GDH na cepa laboratorial fornece às bactérias uma vantagem de crescimento seletiva quando o glutamato exógeno é escasso2. Além disso, o cultivo de uma cepa B. subtilis, sintetizando o GDH GudB, na ausência de glutamato exógeno resulta no acúmulo de mutantes supressores que inativaram o gene gudB 2. Obviamente, a presença de um GDH catabolicamente ativo é desvantajosa para a célula porque o glutamato produzido endógenamente que poderia ser usado para o anabbolismo é degradado para amônio e 2-oxoglutarate(Figura 1). Em contraste, quando o glutamato é fornecido pelo meio, uma cepa B. subtilis equipada com atividade GDH de alto nível tem uma vantagem de crescimento seletiva sobre uma cepa que sintetiza apenas um GDH funcional. É razoável supor que a atividade gdh de alto nível permite que as bactérias utilizem o glutamato como segunda fonte de carbono, além de outras fontes de carbono fornecidas pelo meio2 (ver Figura 1). Assim, a atividade GDH afeta fortemente o condicionamento físico das bactérias, dependendo da disponibilidade de glutamato exógeno.
Aqui apresentamos um método muito ilustrativo para monitorar e visualizar a competição intraespécie entre duas cepas de B. subtilis que diferem em um único lócus no cromossomo(Figura 2). As duas cepas foram rotuladas com os genes YFP e CFP codificando os fluoroforos YFP e CFP, e cocultivadas em diferentes condições nutricionais. Através da amostragem ao longo do tempo e emplacando diluições apropriadas em placas de ágar, os sobreviventes em cada uma das culturas poderiam ser facilmente monitorados usando um microscópio de fluorescência estéreo comum. O procedimento descrito neste artigo é fácil de realizar e adequado para visualizar a rápida expansão clonal e eliminação de mutações benéficas e prejudiciais, respectivamente, em uma população celular ao longo do tempo.
Vários métodos foram desenvolvidos para analisar a aptidão competitiva das bactérias16. Em muitos casos, as bactérias foram rotuladas com diferentes fitas de resistência a antibióticos17. Semelhante à nossa abordagem, a rotulagem das células com fitas de resistência a antibióticos permite a avaliação da aptidão competitiva das bactérias durante a cocultivação em condições de crescimento definidas. Além disso, este método pode ser usado para determinar a aptidão competitiva das …
The authors have nothing to disclose.
O trabalho no laboratório dos autores foi apoiado pela Deutsche Forschungsgemeinschaft (http://www.dfg.de; CO 1139/1-1), a Fonds der Chemischen Industrie (http://www.vci.de/fonds) e o Centro de Biologia Molecular de Göttingen (GZMB). Os autores gostariam de reconhecer Jörg Stülke por comentários úteis e leitura crítica do manuscrito.
(NH4)2SO4 | Roth, Germany | 3746 | – |
Agar | Difco, USA | 214010 | – |
Ammonium ferric citrate (CAF) | Sigma-Aldrich, Germany | 9714 | – |
CaCl2 | Roth, Germany | 5239 | – |
Glucose | Applichem, Germany | A3617 | – |
Glycerol | Roth, Germany | 4043 | – |
K2HPO4 x 3 H2O | Roth, Germany | 6878 | – |
KCl | Applichem, Germany | A3582 | – |
KH2PO4 | Roth, Germany | 3904 | – |
KOH | Roth, Germany | 6751 | – |
MgSO4 x 7 H2O | Roth, Germany | P027 | – |
MnCl2 | Roth, Germany | T881 | – |
MnSO4 x 4 H2O | Merck Millipore, Germany | 102786 | – |
NaCl | Roth, Germany | 9265 | – |
Nutrient broth | Roth, Germany | X929 | – |
Potassium glutamate | Applichem, Germany | A3712 | – |
Tryptone | Roth, Germany | 8952 | – |
Tryptophan | Applichem, Germany | A3445 | – |
Yeast extract | Roth, Germany | 2363 | – |
1.5 ml Reaction tubes | Sarstedt, Germany | 72,690,001 | – |
2.0 ml Reaction tubes | Sarstedt, Germany | 72,691 | – |
15 ml Plastic tubes with screw cap | Sarstedt, Germany | 62,554,001 | – |
Petri dishes | Sarstedt, Germany | 82.1473 | – |
1.5 ml Polystyrene cuvettes | Sarstedt, Germany | 67,742 | – |
15 ml Glass culture tubes | Brand, Germany | 7790 22 | – |
with aluminium caps | |||
100 ml Shake flasks with aluminium caps | Brand, Germany | 928 24 | – |
Sterile 10 ml glass pipettes | Brand, Germany | 278 23 | – |
Incubator (28 and 37 °C) | New Brunswick | M1282-0012 | – |
Standard pipette set (2-20 μl, 10-100 μl, 100-1000 μl) | Eppendorf, Germany | 4910 000.034, 4910 000.042, | – |
4910 000.042, | |||
4910 000.069 | |||
Table top centrifuge for 1.5 and 2 ml reaction tubes | Thermo Scientific, Heraeus Fresco 21, Germany | 75002425 | – |
Table top centrifuge for 15 ml plastic tubes | Heraeus Biofuge Primo R, Germany | 75005440 | – |
Standard spectrophotometer | Amersham Biosciences Ultrospec 2100 pro, Germany | 80-2112-21 | – |
Stereofluorescence microscope | Zeiss SteREO Lumar V12, Germany | 495008-0009-000 | – |
Freezer (-20 and -80 °C) | – | – | – |
Fridge (4 °C) | – | – | – |
Autoclave | Zirbus, LTA 2x3x4, Germany | – | – |
pH meter | pH-meter 766, Calimatic, Knick, Germany | 766 | – |
Vortex | Vortex 3, IKA, Germany | 3340000 | – |
Balance | CP2202S, Sartorius, Germany | replaced by | – |
CPA2202S | |||
Black pen (permanent marker) | Staedler, Germany | 317-9 | – |
Powerpoint program | Microsoft, USA | – | – |
Office Excel program | Microsoft, USA | – | Program for data processing |
Adobe Photoshop CS5 | Adobe, USA | replaced by CS6, download | Computer program for image processing |
Computer | PC or Mac | – | – |
ZEN pro 2011 software for the stereofluorescence microscope | Zeiss, Germany | 410135 1002 110 | AxioCam MRc Rev. Obtained through Zeiss |
Specific solution recipes | |||
SP medium | |||
8 g Nutrient broth | |||
0.25 mg MgSO4 x 7 H2O | |||
1 g KCl | |||
if required, add 15 g agar for solid SP medium | |||
ad 1 l with H2O, autoclave for 20 min at 121 °C | |||
1 ml CaCl2 (0.5 M), sterilized by filtration | |||
1 ml MnCl2 (10 mM) sterilized by filtration | |||
2 ml ammonium ferric citrate (CAF, 2.2 mg/ml), sterilized by filtration | |||
LB medium | |||
10 g Tryptone | |||
5 g Yeast extract | |||
10 g NaCl | |||
if required, add 15 g agar for solid LB medium | |||
ad 1 l with H2O, autoclave for 20 min at 121 °C | |||
C-Glc minimal medium | |||
200 ml 5 x C salts | |||
10 ml L-Tryptophan (5 mg/ml), sterilized by filtration | |||
10 ml ammonium ferric citrate (CAF, 2.2 mg/ml), sterilized by filtration | |||
10 ml III’ salts | |||
25 ml Glucose (20%), autoclaved for 20 min at 121 °C | |||
ad 1 l with sterile H2O | |||
CE-Glc minimal medium | |||
200 ml 5 x C salts | |||
10 ml L-Tryptophan (5 mg/ml), sterilized by filtration | |||
10 ml ammonium ferric citrate (CAF, 2.2 mg/ml), sterilized by filtration | |||
10 ml III’ salts | |||
20 ml Glutamate (40%) | |||
25 ml Glucose (20%), autoclaved for 20 min at 121 °C | |||
ad 1 l with sterile H2O | |||
5 x C salts | |||
20 g KH2PO4 | |||
80 g K2HPO4 x 3 H2O | |||
16.5 g (NH4)2SO4 | |||
ad 1 l with sterile H2O, autoclave for 20 min at 121 °C | |||
III’ salts | |||
0.232 g MnSO4 x 4 H2O | |||
12.3 g MgSO4 x 7 H2O | |||
ad 1 l with sterile H2O, autoclave for 20 min at 121 °C | |||
40% Glutamate solution | |||
200 g L-Glutamic acid | |||
adjust the pH to 7.0 by adding approximately 80 g KOH | |||
ad 0.5 l with sterile H2O, autoclave for 20 min at 121 °C | |||
0.9% Saline (NaCl) solution | |||
ad 1 l with sterile H2O, autoclave for 20 min at 121 °C | |||
50% Glycerol solution | |||
295 ml Glycerol (87%) | |||
ad 0.5 l with sterile H2O, autoclave for 20 min at 121 °C | |||
Bacteria (All strains are based on the Bacillus subtilis strain 168) | |||
Bacillus subtilis BP40 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-yfp) | Laboratory strain collection | ||
Bacillus subtilis BP41 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-cfp) | |||
Bacillus subtilis BP52 (rocG+ gudB+ amyE::PgudB-cfp) | |||
Bacillus subtilis BP156 (rocG+ gudB+ amyE::PgudB-yfp) |