Citotóxicos Eficácia da Terapia Fotodinâmica no osteossarcoma Células<em> In Vitro</em

Summary

O protocolo relatado aqui permite a avaliação da eficácia da terapia fotodinâmica (PDT) em linhas de células e a optimização das condições de PDT, antes de aplicar a terapia em modelos animais.

Abstract

Nos últimos anos, tem sido a dificuldade em encontrar terapias mais eficazes contra o câncer com menos efeitos colaterais sistêmicos. Portanto Terapia Fotodinâmica é uma nova abordagem para um tratamento selectivo mais tumor.

Terapia Fotodinâmica (PDT) que faz uso de um fotossensibilizador não tóxico (PS), que, após a activação com luz de um comprimento de onda específico, na presença de oxigénio, gera radicais livres de oxigénio, que provocam uma resposta citotóxica ^1. Apesar de sua aprovação há quase vinte anos pelo FDA, PDT hoje é apenas usado para tratar um número limitado de tipos de câncer (de pele, bexiga) e doenças nononcological (psoríase, queratose actínica) ^2.

A principal vantagem da utilização da TFD é a capacidade de executar um tratamento local, o que evita os efeitos secundários sistémicos. Além disso, permite o tratamento de tumores em locais delicados (por exemplo, em torno de nervos ou vasos sanguíneos). Aqui, um intraoperataplicação ive do PDT é considerada no osteossarcoma (OS), um tumor do osso, para atingir satélites tumor primário deixado para trás em torno do tecido tumoral após a ressecção cirúrgica do tumor. O tratamento tem como objetivo diminuir o número de recidivas e na redução do risco de (pós-operatório) metástase.

No presente estudo, apresentamos in vitro procedimentos PDT para estabelecer as configurações PDT ideais para o tratamento eficaz de linhas de células do sistema operacional amplamente utilizados que são usados ​​para reproduzir a doença humana em modelos do rato OS intratibial bem estabelecidos. A captação do PS mTHPC foi examinada com um espectrofotómetro e fototoxicidade foi provocado com a luz laser de excitação de mTHPC em 652 nm para induzir a morte celular avaliada com um ensaio de WST-1 e pela contagem de células sobreviventes. As técnicas estabelecidas nos permitem definir as configurações PDT ideais para futuros estudos em modelos animais. Eles são uma ferramenta fácil e rápida para a avaliação da eficácia da TFD <em> In vitro antes de uma aplicação in vivo.

Introduction

Estado da arte do tratamento de osteossarcoma (OS) de hoje, um tumor ósseo primário, abrange uma combinação de quimioterapia adjuvante e neo cirurgia. Este regime de tratamento revelou um aumento na taxa de sobrevivência de pacientes com doença localizada a partir de cerca de 20% antes do uso de quimioterapia, a atualmente entre 60-70% ^{3, 4.} No entanto, nas últimas duas décadas, a sobrevida global dos pacientes com doença do sistema operacional local tem plateaued ^{4, 5.} Além disso, 30-40% dos pacientes com recaída no prazo de 3 anos após o diagnóstico e os pacientes com doença metastática continuam a ter uma fraca sobrevivência de 20-30% ^{4, 6, 7.} Para melhorar o resultado de esses pacientes, novas estratégias terapêuticas têm de ser desenvolvidas.

Terapia Fotodinâmica (PDT), uma terapia anticâncer em vez novela, usa a luz de um comprimento de onda específico para a excitação de um photosensiTizer (PS), que se acumula nas células tumorais após a sua injecção na corrente sanguínea. A luz do laser de excitação do PS gera radicais de oxigénio, na presença de oxigénio, os quais induzem a reacção citotóxica em células tumorais e a morte celular. Além deste mecanismo primário, dois PDT adicional evocado processos biológicos contribuir para o crescimento do tumor reduzido: TFD causa a vasoconstrição e a formação de trombos da microcirculação do tumor e, consequentemente, a hipóxia e anóxia locais no interior do tumor, levando a enfarte do tumor. Finalmente, PDT feridos e moribundos células tumorais desencadear uma resposta imune local, uma característica bastante singular do PDT. Isto envolve o sistema do complemento e a activação das células apresentadoras de antigénios dendríticas ^8. Assim, são criadas condições para a apresentação de antígenos tumorais com subsequente ativação de células linfóides, levando a imunidade específica do tumor.

Até agora, a terapia fotodinâmica tem sido utilizada para tratar diversos tipos de tumores de tecidos moles e hyperplásia de, como a ceratose actínica, esôfago de Barrett, tumores endobrônquica, câncer de bexiga, carcinomas basocelulares e tratamento paliativo de câncer de cabeça e pescoço ^2. O tratamento é conhecido por induzir a necrose de grande escala local com apenas pequenos efeitos secundários, e, portanto, tem o potencial para eliminar selectivamente o tecido do tumor. Apesar destas vantagens, a aplicação de PDT permanece tecnicamente mais exigente do que a administração de fármacos quimioterapêuticos. A fim de atingir a eficácia máxima, a concentração de PS, o tempo de exposição à luz e de transferência total de energia de luz têm de ser optimizados. Isto pode ser feito em experiências in vivo, mas, por causa do grande número relativo de parâmetros que têm de ser optimizados, é mais eficiente para determinar inicialmente a condições óptimas in vitro.

Nas experiências descritas em seguida, testou-se a eficácia in vitro de PDT utilizando o PS 5,10,15,20-tetraquis-(meta-hidroxifenil) chlorin, abreviado mTHPC (Figura 1A). mTHPC é a substância activa do medicamento Foscan, que é usado atualmente na clínica para o tratamento paliativo de câncer de cabeça e pescoço. É um dos PS mais potente, induzindo enormes danos celulares já em baixas concentrações, e demonstrou-se ser superior a outras PS em termos de penetração do tecido ^{9, 10.} O seu espectro de absorção de luz (Figura 1B) mostra dois picos proeminentes, uma em 417 nm e um segundo de 652 nm, que são utilizados para a localização de tecido de acumulação de PS e para a indução de PDT, respectivamente.

Atualmente, uma formulação lipossomal para mTHPC está em desenvolvimento. Aqui, descrevemos os procedimentos para quantificar a absorção desta formulação lipossomal, e para realizar PDT em duas linhas de células do sistema operacional humanos, o baixo HOS metastático e as células metastáticas 143B altos. Alguns dos dados aqui apresentados foram relatados anteriormente ^11. The abordagem aqui descrita permite-nos estudar o efeito de um fenótipo metastático em PDT eficácia. Células 143B, ortotopicamente injetadas nos membros posteriores de ratos SCID imunodeficientes causar tumores primários metástase intratibial, um modelo que imita de perto a doença metástase humana. Assim, as experiências in vitro propostos são perfeitamente adequados para avaliar os ajustes de PDT óptimas para ser usado mais tarde em experiências in vivo.

Protocol

1. Comparação da absorção de mTHPC no Baixo respectiva e altamente metastático HOS e 143B OS linhas celulares Prepare a meio de cultura celular contendo DMEM, F12 de Ham, e inactivado por calor soro fetal de vitelo numa 4.5:4.5:1 proporção. Nota: A formulação lipossomal do PS mTHPC foi dissolvido em água a uma concentração final de 1,5 mg / ml mTHPC. Placa de 0,2 x 10 6 e as células HOS 143B / poço em placas de 6 poços (triplica para cada condição)…

Representative Results

Com as técnicas aqui relatadas, investigamos PDT-based mTHPC em células do sistema operacional humanos. Primeiro, o tempo e a dose de absorção dependente mTHPC foi investigada no baixo HOS metastático e nas linhas de células 143B OS altamente metastáticas. mTHPC absorção pode ser avaliada através da medição da fluorescência de mTHPC com um espectrofotómetro de fluorescência (Figura 2, reproduzida com a permissão do Reidy et al. 11). Figura 2A ilustra …

Discussion

Para alcançar citotoxicidade ideal em resposta a PDT, é fundamental para escolher as configurações de luz de laser direita e tempos de incubação. Os procedimentos aqui descritos são consistentes e eficiente para determinar a absorção de PS e para quantificar a citotoxicidade induzida por PDT, in vitro. Usando os comprimentos de onda de absorção específicas do PS mTHPC, a absorção PS celular pode ser determinada de um modo directo, e o PS pode ser activada para gerar espécies reactivas de oxigéni…

Materials

DMEM	PAA GmbH, Freiburg, Germany	E15-883
HAM F12	PAA GmbH, Freiburg, Germany	E15-817
heat-inactivated fetal calf serum	GIBCO, Basel, Switzerland	10500-064
mTHPC	biolitec research GmbH, Jena, Germany		As this liposomal formulation is originating from R & D no catalogue number is available at the moment. Stock: 1.5mg/ml; provided in a 9:1 mixture of dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC) and dipalmitoylphosphatidylglycerol (DPPG; >99% purity)
Spectramax Gemini XS plate reader	Molecular Devices, Sunnyvale, CA	ID# 861
Microscope Zeiss Observer.Z1	Axio Observer, Axio Vision Release 4.6.3 SP1, Jena Germany
Ceralas PDT 652 nm Laser	Biolitec AG, Jena, Germany	LD652nm2W400u
Water-soluble tetrazolium (WST) reagent	Roche Diagnostics AG, Rotkreuz, Switzerland	1644807