Цитотоксическая Эффективность фотодинамической терапии в клетках остеосаркомы<em> Экстракорпоральное</em
Summary
Протокол сообщил здесь позволяет оценка эффективности фотодинамической терапии (PDT) в клеточных линиях и оптимизации настроек PDT перед нанесением терапии на животных моделях.
Abstract
В последние годы наблюдается трудность в нахождении более эффективные терапии против рака с меньшим количеством системных побочных эффектов. Поэтому фотодинамическая терапия является подход роман для более опухоли селективной очистки.
Фотодинамическая терапия (PDT), что делает использование нетоксичного фотосенсибилизатора (PS), который, при активации светом определенной длины волны в присутствии кислорода, генерирует радикалы кислорода, которые вызывают цитотоксический ответ 1. Несмотря на утверждения почти двадцать лет назад FDA, PDT ныне используется только для лечения ограниченное количество типов рака (кожи, мочевого пузыря) и nononcological заболеваний (псориаз, старческий кератоз) 2.
Основное преимущество использования ФДТ является возможность выполнить местное лечение, которое предотвращает системные побочные эффекты. Кроме того, она позволяет лечение опухолей в деликатных участках (например вокруг нервов или кровеносных сосудов). Здесь intraoperatПриложение ив ФДТ рассматривается в остеосаркома (ОС), опухоль кости, целевой первичных спутников опухолевые остались в опухоли окружающие ткани после хирургического удаления опухоли. Лечение направлено на уменьшение количества рецидивов и на снижение риска для (послеоперационном) метастазов.
В настоящем исследовании мы представляем в пробирке процедуры PDT установить оптимальные настройки PDT для эффективного лечения широко используемых клеточных линий ОС, которые используются для воспроизведения заболевания человека в хорошо зарекомендовавших себя intratibial моделей ОС мыши. Поглощение ПС mTHPC был рассмотрен с помощью спектрофотометра и фототоксичность был спровоцирован лазерным светом возбуждения mTHPC на 652 нм, чтобы вызвать гибель клеток оценена с WST-1 анализа и подсчета выживших клеток. Установленные методы позволяют определить оптимальные настройки PDT для будущих исследований на животных моделях. Они легко и быстро инструментом для оценки эффективности PDT <em> В пробирке до приложения в естественных условиях.
Introduction
Сегодняшнее состояние лечения искусства остеосаркомы (ОС), первичная опухоль кости, охватывает комбинацию нео адъювантной химиотерапии и хирургии. Это схема лечения выявлено увеличение выживаемости пациентов с локализованным заболеванием от примерно 20% до использования химиотерапии, чтобы в настоящее время между 60-70% 3, 4. Тем не менее, в последние два десятилетия, общая выживаемость больных ОС с местным заболевания плато 4, 5. Кроме того, 30-40% этих пациентов рецидив в течение 3 лет после постановки диагноза и пациентов с метастазами по-прежнему имеют плохую выживание 20-30% 4, 6, 7. Чтобы улучшить результат этих пациентов, новые терапевтические стратегии должны быть разработаны.
Фотодинамическая терапия (PDT), а роман противоопухолевая терапия, использует свет определенной длины волны для возбуждения PhotosensiТизер (PS), который накапливается в опухолевых клетках после его инъекции в кровоток. Лазерный свет возбуждения генерирует PS кислородных радикалов в присутствии кислорода, которые вызывают цитотоксическую реакцию в опухолевых клеток и гибели клеток. Кроме этого основного механизма, два дополнительных PDT вызвали биологические процессы способствовать уменьшению роста опухоли: PDT вызывает сужение сосудов и образование тромбов в микроциркуляторном опухоли и, следовательно местные гипоксию и аноксию внутри опухоли, что приводит к опухоли миокарда. Наконец, PDT ранены и умирают клетки опухоли вызвать локальный иммунный ответ, довольно уникальную особенность PDT. Это включает в себя систему комплемента и активацию антиген-представляющих дендритных клеток 8. Таким образом, создаются условия для презентации опухолевых антигенов с последующей активацией лимфоидных клеток, что приводит к опухоли специфического иммунитета.
До сих пор, PDT был использован для лечения нескольких типов опухолей мягких тканей и hyperplАзии, таких как светочувствительный кератоз, пищевода Барретта, эндобронхиальных опухолей, рака мочевого пузыря, рака базальных клеток, и паллиативного лечения рака головы и шеи 2. Лечение, как известно, индуцируют некроз, местный крупномасштабное с только небольшими побочными эффектами, и, таким образом, имеет потенциал, чтобы выборочно искоренить опухолевой ткани. Несмотря на эти преимущества, применение ФДТ остается технически более сложным, чем введения химиотерапевтических препаратов. Для достижения максимальной эффективности, концентрацию PS, время воздействия света и общую передачу световой энергии должны быть оптимизированы. Это может быть сделано в естественных экспериментов в, но, из-за относительного большого числа параметров, которые должны быть оптимизированы, он является более эффективным для первоначально определить оптимальные условия в пробирке.
В экспериментах, описанных ниже, мы протестировали эффективность в пробирке ФДТ с использованием PS 5,10,15,20-тетракис (мета-гидроксифенил) CHLОрин, сокращенно mTHPC (рис. 1А). mTHPC является действующим веществом в лекарственного средства Foscan, который в настоящее время используется в клинике для паллиативного лечения рака головы и шеи. Это один из самых мощных ПС, вызывая массовые повреждения клеток уже при низких концентрациях, и было показано, что превосходит другой ПС с точки зрения проникновения в ткани 9, 10. Его поглощения светового спектра (рис. 1В) показаны два выраженные пики, по одному 417 нм и второй на 652 нм, которые используются для тканевой локализации накопления PS и для индукции PDT, соответственно.
В настоящее время, липосомальный формулировка для mTHPC находится в стадии разработки. Здесь мы описываем процедуры количественной оценки поглощение этого липосомного препарата и выполнять PDT в две линии ОС клеток человека; низкую метастатического HOS и высокие метастатические клетки 143b. Некоторые из приведенных данных были сообщалось ранее 11. Чтэ Описанный здесь подход позволяет изучать эффект метастатического фенотипа на PDT эффективности. 143B клетки, ортотопически вводится в задних конечностей иммунодефицитных SCID мышей вызвать intratibial метастазирования первичной опухоли, модель тесно имитируя человеческую болезнь метастазирования. Таким образом, эксперименты, предложенные в пробирке прекрасно подходят для оценки оптимальные настройки PDT быть позже использованы в естественных экспериментов в.
Protocol
Representative Results
Discussion
Для достижения оптимального цитотоксичность в ответ на PDT, очень важно выбрать правильные настройки лазерного света и времени инкубации. Описанных здесь процедуры соответствуют и эффективным для определения поглощения PS и количественно PDT индуцированной цитотоксичности в пробирк?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить Biolitec Research GmbH (Йена, Германия) за любезно предоставленные нам с формулировкой липосомальный mTHPC, с особой благодарностью Сусанна Grafe и Арно Wiehe за их помощь и технической экспертизы. Мы также хотели бы поблагодарить Керстин Reidy, который генерируется большая часть результатов и был coresponsible для его опубликования 11.
Эта работа была поддержана грантами от Schweizerischer Verein Balgrist, Цюрихском университете, в Krebsliga Цюрихе, а также за счет гранта от Уолтера Л. и Johanna Wolf Foundation, Цюрих, Швейцария и грантом EuroNanoMed ERA-NET / ОЯТ Швейцарии Национальный научный фонд 31NM30-131004/1. Эта работа также была поддержана HSM (узкоспециализированных Медицина) по программам на костно-мышечной онкологии Кантон Цюрих.
Materials
| DMEM | PAA GmbH, Freiburg, Germany | E15-883 | |
| HAM F12 | PAA GmbH, Freiburg, Germany | E15-817 | |
| heat-inactivated fetal calf serum | GIBCO, Basel, Switzerland | 10500-064 | |
| mTHPC | biolitec research GmbH, Jena, Germany | As this liposomal formulation is originating from R & D no catalogue number is available at the moment. Stock: 1.5mg/ml; provided in a 9:1 mixture of dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC) and dipalmitoylphosphatidylglycerol (DPPG; >99% purity) |
|
| Spectramax Gemini XS plate reader | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | ID# 861 | |
| Microscope Zeiss Observer.Z1 | Axio Observer, Axio Vision Release 4.6.3 SP1, Jena Germany | ||
| Ceralas PDT 652 nm Laser | Biolitec AG, Jena, Germany | LD652nm2W400u | |
| Water-soluble tetrazolium (WST) reagent | Roche Diagnostics AG, Rotkreuz, Switzerland | 1644807 |
References
- Juarranz, A., Jaen, P., Sanz-Rodriguez, F., Cuevas, J., Gonzalez, S. Photodynamic therapy of cancer. Basic principles and applications. Clin. Transl. Oncol. 10, 148-154 (2008).
- Agostinis, P., et al. Photodynamic therapy of cancer: an update. CA Cancer. 61, 250-281 (2011).
- D’Adamo, D. R. Appraising the current role of chemotherapy for the treatment of sarcoma. Semin. Oncol. 38 Suppl 3, 19-29 (2011).
- Allison, D. C., et al. A meta-analysis of osteosarcoma outcomes in the modern medical era. Sarcoma. , (2012).
- Anninga, J. K., et al. Chemotherapeutic adjuvant treatment for osteosarcoma: where do we stand. Eur. J. Cancer. 47, 2431-2445 (2011).
- Bacci, G., et al. Pattern of relapse in patients with osteosarcoma of the extremities treated with neoadjuvant chemotherapy. Eur. J. Cancer. 37, 32-38 (2001).
- Briccoli, A., et al. Resection of recurrent pulmonary metastases in patients with osteosarcoma. Cancer. 104, 1721-1725 (2005).
- Milla Sanabria, L., et al. Direct and indirect photodynamic therapy effects on the cellular and molecular components of the tumor microenvironment. Biochim. Biophys. Acta. 1835, 36-45 (2013).
- Mitra, S., Foster, T. H. Photophysical parameters, photosensitizer retention and tissue optical properties completely account for the higher photodynamic efficacy of meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin vs Photofrin. Photochem. Photobiol. 81, 849-859 (2005).
- Ma, L., Moan, J., Berg, K. Evaluation of a new photosensitizer, meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin, for use in photodynamic therapy: a comparison of its photobiological properties with those of two other photosensitizers. Int. J. Cancer. 57, 883-888 (1994).
- Reidy, K., Campanile, C., Muff, R., Born, W., Fuchs, B. mTHPC-mediated photodynamic therapy is effective in the metastatic human 143B osteosarcoma cells. Photochem. Photobiol. 88, 721-727 (2012).
- Triesscheijn, M., Ruevekamp, M., Aalders, M., Baas, P., Stewart, F. A. Comparative sensitivity of microvascular endothelial cells, fibroblasts and tumor cells after in vitro photodynamic therapy with meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin. Photochem. Photobiol. 80, 236-241 (2004).
- Triesscheijn, M., Baas, P., Schellens, J. H., Stewart, F. A. Photodynamic therapy in oncology. Oncologist. 11, 1034-1044 (2006).
- Burch, S., et al. Treatment of canine osseous tumors with photodynamic therapy: a pilot study. Clin. Orthop. Relat. Res. 467, 1028-1034 (2009).
