体内转染和基因敲除在脊髓通过快速无创腰椎鞘内注射小鼠
Summary
这份报告描述了鞘内穿刺针用于siRNA在小鼠脊髓腰段下短持久的浅麻醉局部转染一个简单而快速的方法。
Abstract
这份报告描述了一步一步的指导，急性鞘内注射针在非侵入性的方式方法， 即导管植入独立的。这种手术方法的技术限制在于手中的技巧。注射速度快，特别是对于一个训练有素的实验者，由于这种技术的组织破坏是最小的，反复注射是可能的，而且免疫反应，国外的工具（ 如导尿管）不会发生，从而给人一种更好的和更具体的读出脊髓调制。因为该物质的应用主要限于脊髓的目标区域，药物不需要在大剂量要应用，以及其他的组织更重要的是不需要的效果，如用全身给药观察到的，可以规避1， 2。此外，我们结合该技术在体内转染核酸与polyethylenim的帮助鸟嘌呤（PEI）试剂3，这提供了巨大的灵活性对于通过递送药理学试剂以及基因，RNA和蛋白调节剂研究脊髓功能。
Introduction
脊髓是在多种关键生物学过程和生理功能，包括处理和疼痛（疼痛）投入4-7传输的一个非常重要的中心。各种实验技术已被开发，以促进脊髓，如鞘内导管8的慢性移植，脊髓显微注射，以及鞘内注射针9的药理调制。每种技术都有自己的优点和缺点，并根据实验范式一种技术可能比其他人更适合。而鞘内导管的慢性移植是容易可行的大鼠，这种方法是非常困难的小鼠，给定尺寸的限制。成功率非常低，运动障碍常因导管在鼠标的严重局限硬膜下腔笨重存在发生。此外，长期输送药物是由于频繁的凝血呈现的长期植入导管。最后，免疫反应是常见的。
这些问题可以用急性鞘内注射的方法， 通过在无预先植入的导管，使药物和试剂的快速和解剖学有限应用到小鼠的脊髓中的针来规避。该方法完全保留鞘内递送超过其他全身递送途径（ 如口服，静脉内，腹膜内等 ），如脊髓调制，这允许减少剂量和限制的副作用，以及交付能力的物质没有的特异性的好处通常不跨越血脑屏障，因为鞘内注射过程中，所述针被插入在硬膜和脊髓之间。但重要的是，相较于鞘内交付的其他方法，鞘内注射针方法是最侵入性，允许在多种应用没有造成任何可观的组织损伤或唤起因异物植入免疫反应相同的动物。然而，这需要技术技能的针，以允许效力的非常精确的定位。
在这里，我们直观地验证了该方法实现成功的最佳比率为专门针对腰脊髓。选择在这个实验是注射部位是L5和L6脊椎动物列，近的地方脊髓结束时，以减少损坏的脊椎的可能性之间的槽。此外，我们演示了如何使用这种技术击倒基因的siRNAs使用脊髓。
Protocol
Representative Results
Discussion
因此，鞘内注射针的上述技术是有效的，快速的，特别是局部化和非破坏性。从技术上讲，该过程的最重要的方面是点的针插入的插入槽。至关重要的是，这个过程是用很平静的双手和耐心完成。像许多外科手术，培训提高注射成功率。这也是很重要的，因为在实际的实验中，这种技术没有提供一个明显的指标，以直接地确认注射是否成功与否。正确的进针的唯一可见的指标是观察到的反射甩尾?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| in vivo-jetPEI | Polyplus | 201-10G | |
| WAVE1 siRNA | Santa Cruz | sc-36832 | |
| Control siRNA-A | Santa Cruz | sc-37007 | |
| Anti-ß-Tubulin III antibody | Sigma | T2200 | |
| Anti-WAVE1 antibody | R&D Systems | AF5514 | |
| Fast green dye | Sigma | F-7252 | |
| Isoflurane | Baxter | ||
| Isoflurane setup | Dräger Lübeck | ||
| Shaver | Wella | ||
| Hamilton syringe Gastight 1702 | Hamilton | ||
| 30G 1/2, 0,3 * 13mm Needle | BD Microlance | 304000 | |
| Microscope Leica MS5 | Leica | ||
| WAVE1 forward primer for qRT-PCR | Sigma | cacagagcctcaggacagg | |
| WAVE1 reversed primer for qRT-PCR | Sigma | cttttcaccaacggcatctt | |
| FastStart Essential DNA Green Master | Roche | 6402712001 |
References
- Hylden, J. L., Wilcox, G. L. Intrathecal morphine in mice: a new technique. Eur. J. Pharmacol. 67, 313-316 (1980).
- Stokes, J. A., Corr, M., Yaksh, T. L. Transient tactile allodynia following intrathecal puncture in mouse: contributions of Toll-like receptor signaling. Neurosci. Lett. 504, 215-218 (2011).
- Goula, D., et al. Polyethylenimine-based intravenous delivery of transgenes to mouse lung. Gene Ther. , 1291-1295 (1998).
- Fairbanks, C. A. Spinal delivery of analgesics in experimental models of pain and analgesia. Adv. Drug. Deliv. Rev. 55, 1007-1041 (2003).
- Hohmann, A. G., Tsou, K., Walker, J. M. Cannabinoid modulation of wide dynamic range neurons in the lumbar dorsal horn of the rat by spinally administered WIN55,212-2. Neurosci. Lett. 257, 119-122 (1998).
- Song, Z. H., Takemori, A. E. Involvement of spinal kappa opioid receptors in the antinociception produced by intrathecally administered corticotropin-releasing factor in mice. J. Pharmacol. Exp. Ther. 254, 363-368 (1990).
- Trang, T., Sutak, M., Jhamandas, K. Involvement of cannabinoid (CB1)-receptors in the development and maintenance of opioid tolerance. 신경과학. , 1275-1288 (2007).
- Yaksh, T. L., Rudy, T. A. Chronic catheterization of the spinal subarachnoid space. Physiol. Behav. 17, 1031-1036 (1976).
- Tappe, A., et al. Synaptic scaffolding protein Homer1a protects against chronic inflammatory pain. Nat. Med. , 677-681 (2006).
- Bourinet, E., et al. Silencing of the Cav3.2 T-type calcium channel gene in sensory neurons demonstrates its major role in nociception. EMBO J. 24, 315-324 (2005).
- Wang, X., et al. Gene transfer to dorsal root ganglia by intrathecal injection: effects on regeneration of peripheral nerves. Mol. Ther. 12, 314-320 (2005).
- Wigdor, S., Wilcox, G. L. Central and systemic morphine-induced antinociception in mice: contribution of descending serotonergic and noradrenergic pathways. J. Pharmacol. Exp. Ther. 242, 90-95 (1987).
