В Vivo миРНК трансфекции и Нокдаун гена в спинного мозга через Rapid неинвазивной поясничного Intrathecal инъекций у мышей
Summary
В настоящем докладе описывается простой и быстрый метод интратекальной прокол иглой для локализованной трансфекции миРНК в поясничном спинном мозге у мышей под короткий прочного легкой анестезией.
Abstract
Этот отчет описывает шаг за шагом руководство по технике острых интратекальных инъекций иглой в неинвазивной образом, то есть не зависит от катетера имплантации. Технический ограничение этого хирургического метода заключается в изяществом руках. Инъекция является быстрым, особенно для обученного экспериментатора, и с тех тканей нарушение с этой техникой минимальна, повторные инъекции возможны, причем иммунная реакция на иностранных инструментов (. Например катетер) не происходит, тем самым давая лучшее и более конкретные зачитал спинного модуляции мозга. Поскольку применение вещества в значительной степени ограничивается целевой области спинного мозга, препараты не должны применяться в больших дозах, и что более важно нежелательные воздействия на другие ткани, как это наблюдалось с системной доставки, может быть обойдена 1, 2. Кроме того, этот метод сочетать с трансфекции в естественных нуклеиновых кислот с помощью polyethylenimине (PEI) реагент 3, который обеспечивает огромную универсальность для изучения функции спинного через доставку фармакологических агентов, а также ген, РНК и белка модуляторов.
Introduction
Спинной мозг является очень важным центр в различных ключевых биологических процессов и физиологических функций, в том числе обработки и передачи болевых (ноцицептивных) входов 4-7. Различные экспериментальные методы были разработаны, чтобы облегчить фармакологическое модуляцию спинного мозга, таких как хронической имплантации интратекальных катетеров 8, спинного мозга, микроинъекции и интратекального введения иглы 9. Каждый метод имеет свои преимущества и недостатки, и в зависимости от эксперимента парадигмы одна техника может быть более подходящим, чем другие. В то время как хроническая имплантация интратекальных катетеров легко осуществимо в крысу, этот метод очень трудно в мыши, учитывая ограничения на размер. Успех составляет очень низкий и дефицит моторных часто происходят из-за громоздких присутствии катетера в строго ограниченном субдуральной пространства в мыши. Кроме того, долгосрочные поставки наркотиков оказывается из-за частого свертыванияхронически имплантировали катетеры. Наконец, иммунные реакции являются общими.
Эти проблемы можно обойти с помощью метода острой интратекального инъекции через иглу в отсутствии preimplanted катетера, который позволяет быстро и анатомически ограниченное применение препаратов и реагентов к спинного мозга у мышей. Этот способ полностью сохраняет преимущества интратекального доставки по сравнению с другими системными способами доставки (например, орального, внутривенного, внутрибрюшинного, и т.д.), такие как специфичности спинного модуляции, которая позволяет уменьшенные дозы и предел побочных эффектов, а также способности обеспечивать вещества не обычно не пересекают гематоэнцефалический барьер, так как во время интратекальной инъекции, игла вводится между твердой мозговой оболочки и спинного мозга. Важно отметить, однако, по сравнению с другими методами интратекального доставки, интратекального метод инъекционной иглы является наименее инвазивным, позволяя многочисленные применения вже животное, не причинив никакого значительного повреждения тканей или вызывая иммунную реакцию из-за имплантации инородного материала. Тем не менее, это требует технических навыков для очень точного нацеливания иглы, чтобы позволить эффективность.
Здесь мы визуально продемонстрировать способ достижения оптимального показатель успеха для специально нацеленные на поясничную область спинного мозга. Место инъекции, которая выбрана в этом эксперименте является паз между L5 и L6 позвоночных колонке, рядом с котором спинной мозг заканчивается, чтобы свести к минимуму возможность повреждения позвоночника. Кроме того, мы демонстрируем использование этой техники, чтобы сбить генов в спинном мозге с помощью миРНК.
Protocol
Representative Results
Discussion
Таким образом, вышеописанная методика интратекальных инъекций иглы является эффективным, быстро, в частности, локализованные и неразрушающий. Технически, наиболее важным аспектом этой процедуры является точка введения иглы в канавку. Очень важно, чтобы эта процедура делается с очень …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| in vivo-jetPEI | Polyplus | 201-10G | |
| WAVE1 siRNA | Santa Cruz | sc-36832 | |
| Control siRNA-A | Santa Cruz | sc-37007 | |
| Anti-ß-Tubulin III antibody | Sigma | T2200 | |
| Anti-WAVE1 antibody | R&D Systems | AF5514 | |
| Fast green dye | Sigma | F-7252 | |
| Isoflurane | Baxter | ||
| Isoflurane setup | Dräger Lübeck | ||
| Shaver | Wella | ||
| Hamilton syringe Gastight 1702 | Hamilton | ||
| 30G 1/2, 0,3 * 13mm Needle | BD Microlance | 304000 | |
| Microscope Leica MS5 | Leica | ||
| WAVE1 forward primer for qRT-PCR | Sigma | cacagagcctcaggacagg | |
| WAVE1 reversed primer for qRT-PCR | Sigma | cttttcaccaacggcatctt | |
| FastStart Essential DNA Green Master | Roche | 6402712001 |
References
- Hylden, J. L., Wilcox, G. L. Intrathecal morphine in mice: a new technique. Eur. J. Pharmacol. 67, 313-316 (1980).
- Stokes, J. A., Corr, M., Yaksh, T. L. Transient tactile allodynia following intrathecal puncture in mouse: contributions of Toll-like receptor signaling. Neurosci. Lett. 504, 215-218 (2011).
- Goula, D., et al. Polyethylenimine-based intravenous delivery of transgenes to mouse lung. Gene Ther. , 1291-1295 (1998).
- Fairbanks, C. A. Spinal delivery of analgesics in experimental models of pain and analgesia. Adv. Drug. Deliv. Rev. 55, 1007-1041 (2003).
- Hohmann, A. G., Tsou, K., Walker, J. M. Cannabinoid modulation of wide dynamic range neurons in the lumbar dorsal horn of the rat by spinally administered WIN55,212-2. Neurosci. Lett. 257, 119-122 (1998).
- Song, Z. H., Takemori, A. E. Involvement of spinal kappa opioid receptors in the antinociception produced by intrathecally administered corticotropin-releasing factor in mice. J. Pharmacol. Exp. Ther. 254, 363-368 (1990).
- Trang, T., Sutak, M., Jhamandas, K. Involvement of cannabinoid (CB1)-receptors in the development and maintenance of opioid tolerance. 신경과학. , 1275-1288 (2007).
- Yaksh, T. L., Rudy, T. A. Chronic catheterization of the spinal subarachnoid space. Physiol. Behav. 17, 1031-1036 (1976).
- Tappe, A., et al. Synaptic scaffolding protein Homer1a protects against chronic inflammatory pain. Nat. Med. , 677-681 (2006).
- Bourinet, E., et al. Silencing of the Cav3.2 T-type calcium channel gene in sensory neurons demonstrates its major role in nociception. EMBO J. 24, 315-324 (2005).
- Wang, X., et al. Gene transfer to dorsal root ganglia by intrathecal injection: effects on regeneration of peripheral nerves. Mol. Ther. 12, 314-320 (2005).
- Wigdor, S., Wilcox, G. L. Central and systemic morphine-induced antinociception in mice: contribution of descending serotonergic and noradrenergic pathways. J. Pharmacol. Exp. Ther. 242, 90-95 (1987).
