عزل mRNAs والمرتبطين مع الميتوكوندريا الخميرة لدراسة آليات المترجمة ترجمة

Summary

وترتبط العديد من mRNAs وترميز البروتينات الميتوكوندريا مع الغشاء الخارجي الميتوكوندريا. نحن تصف الإجراء تجزيء التحت خلوية تهدف إلى عزل الميتوكوندريا الخميرة مع mRNAs والمرتبطة به وريبوسوم. ويمكن تطبيق هذا البروتوكول إلى الخلايا المزروعة تحت ظروف متنوعة من أجل الكشف عن آليات مرنا التعريب والترجمة المترجمة بالقرب من الميتوكوندريا.

Abstract

يتم ترميز معظم البروتينات الميتوكوندريا في النواة وتحتاج إلى استيرادها إلى عضية. قد تحدث الاستيراد في حين يتم تصنيع البروتين بالقرب من الميتوكوندريا. ويستمد الدعم لهذا الاحتمال من الدراسات التي أجريت مؤخرا، والتي عرضت العديد من mRNAs وترميز البروتينات الميتوكوندريا إلى أن تكون مترجمة إلى جوار الميتوكوندريا. جنبا إلى جنب مع المظاهرات السابقة من جمعية ريبوسوم 'مع الغشاء الخارجي، وتشير هذه النتائج إلى عملية الترجمة المترجمة. هذه الترجمة المترجمة قد تحسين كفاءة الاستيراد وتوفير مواقع التنظيم فريدة من نوعها وتقليل حالات التعبير خارج الرحم. وقد استخدمت أساليب متنوعة لتوصيف العوامل والعناصر التي تتوسط الترجمة المترجمة. المعيار بين هذه هو تجزيء التحت خلوية بواسطة الطرد المركزي التفاضلي. هذا البروتوكول له ميزة عزل mRNAs و، ريبوسوم والبروتينات في إجراء واحد. ويمكن بعد ذلك تتميز هذه من قبل مختلف الجزيئية وثنائيةطرق ochemical. علاوة على ذلك، transcriptomics والبروتينات أساليب يمكن تطبيقها على المواد الناتجة، وبالتالي تسمح رؤى على نطاق الجينوم. استخدام الخميرة كما كائن نموذج لمثل هذه الدراسات لديها مزايا السرعة والتكاليف والبساطة. وعلاوة على ذلك، فإن الأدوات الجينية المتقدمة وسلالات حذف متاحة تسهيل التحقق من العوامل مرشح.

Introduction

ويتم تنظيم الخلايا حقيقية النواة في مقصورات متميزة ذات وظائف محددة. لإنجاز مهمتها، كل مقصورة تحتوي على مجموعة فريدة من البروتينات الضرورية لنشاطها. آلية يمكن من خلال هذه البروتينات التي تقترب المقصورة الخاصة بهم هي مترجمة ^1،2 الترجمة. في هذه العملية، ويتم تصنيع البروتين في وجهتها من قبل ريبوسوم وmRNAs والتي تقع هناك. من بين المزايا المحتملة للترجمة المترجمة وزيادة كفاءة استهداف البروتين، انخفضت الحاجة الى المحرمين البروتين، وتمكين آليات التنظيم للموقع المحدد. أيضا، mRNAs والمترجمة وريبوسوم يمكن أن يكون خزان منعزل الآلات الترجمة في حالات الإجهاد الخلوية، عندما يتم تثبيط الترجمة العامة.

أصبح الميتوكوندريا في السنوات الأخيرة نموذجا المركزية لدراسة الترجمة المترجمة. يتم ترميز معظم البروتينات الميتوكوندريا في النواة، وترجم في العصارة الخلوية،والمستوردة إلى عضية. خطوط مختلفة من الأدلة تشير إلى أن العديد من هذه البروتينات يتم إنتاجها من خلال عملية الترجمة المحلية. في البداية، الكشف عن المجهر الإلكتروني وتجزئة البيوكيميائية الدراسات ريبوسوم المرتبطة الميتوكوندريا ^3-5. هذه الدراسات حيث ثم تؤكده في الجسم الحي بواسطة العمل على mRNAs ومحددة، التي وجدت لتكون مستوردة فقط بطريقة ^6،7 cotranslational. كشفت دراسات الجينوم على نطاق من mRNAs وبالتعاون مع الميتوكوندريا أن جزءا كبيرا من mRNAs وتكون مترجمة إلى جوار الميتوكوندريا ^8-10. وتميزت بعض هذه mRNAs ومزيدا من التألق في الجسم الحي الأساليب، مثل الأسماك أو mTAG ^9،11. تفسير مستقيم إلى الأمام من هذا الارتباط هو أن هذه mRNAs وتكون بمثابة نماذج لترجمة المترجمة.

الآليات التي هذه mRNAs والاقتراب من الميتوكوندريا غير معروفة. المجالات غير المكودة (معظم significantlعرضت ذ 3 'UTRs) أن تشارك في تكوين الجمعيات مرنا إلى الميتوكوندريا ^12. من المرجح أن يكون بمثابة موقع ملزم للبروتينات ملزمة الحمض النووي الريبي الذي توسط نقلها هذه المجالات. كشفت الدراسات في الخميرة أن عضوا من عائلة PUM من البروتينات (Puf3) تدعم جمعية مرنا مع الميتوكوندريا ^8،13. دور معقول لPuf3، الذي يقوم على أساس وظائف من أفراد الأسرة الآخرين، هو أن تمنع الترجمة بينما هو في طريقه مرنا ^14. وبالتالي، يمكن نقلها من mRNAs في حالة nontranslated، من خلال البروتينات ملزمة الحمض النووي الريبي التي تتفاعل مع المناطق غير المكودة. بدلا من ذلك، مجموعة كبيرة من العمل تشير إلى أن يحدث النقل في الوقت الذي يجري تصنيعه البروتين. على وجه الخصوص، وقد أظهرت مثبطات ترجمة تؤثر mRNAs وجمعية ^8،13. وعلاوة على ذلك، وميزات ترجمة مثل أغسطس، عرضت الميتوكوندريا تسلسل الاستهداف (MTS) أو المناطق ORF للمساعدة في توطين ^8،11،15. HSP70 الأسرة الفصل البروتينعرضت aperone ومستقبلات البروتين على الغشاء الخارجي الميتوكوندريا أيضا لدعم الجمعيات مرنا، مما يعني أن المزيد من الميزات المشفرة البروتين مهمة لتوطين مرنا ^16. وهذا يتفق مع نموذج الذي البروتين الناشئة الريبوسوم بمثابة عنصر الاعتراف لاستهداف مجمع مرنا-الريبوسوم البروتين إلى ¹⁷ الميتوكوندريا.

وقد درست الترجمة المترجمة بالقرب من الميتوكوندريا عن طريق وسائل مختلفة، بما في ذلك المجهر الإلكتروني (لتصور ريبوسوم) ^3، FISH ^9، RNA الخضراء (للكشف عن mRNAs ومحددة) ^11، وتجزئة البيوكيميائية (للكشف عن كل من الحمض النووي الريبي وريبوسوم) ^10،18. في حين أن وسائل التعريب السابق كشف في الجسم الحي، وربما يسمح التصور من ديناميات النقل، وهذا الأخير يسمح الكشف عن العديد من المختلف في mRNA في تجربة واحدة. علاوة على ذلك، لالبيوكيميائية الترميز تجزئة أو غير المكودة المجالات لا تحتاج إلى أن تكون آلtered، وبالتالي يمكن تقييم الأدوار الخاصة بهم. وقد استخدمت تجزئة البيوكيميائية بنجاح لسنوات عديدة، لعزل العديد من المقصورات الخلوية المختلفة. وراسخة ومبادئها والقيود، ويمكن للمرء بسهولة تعديل البروتوكولات القائمة لأغراض مختلفة. والأجهزة اللازمة هو المعيار في العديد من المختبرات، لذلك فإنه عادة ما يكون الأسلوب الأول من خيار للدراسة توطين داخل الخلايا. نحن تصف البروتوكول الذي تم الأمثل لعزل mRNAs وبينما ترتبط ريبوسوم مع الميتوكوندريا. بالتالي فإن هذا البروتوكول هو الأمثل لدراسة العوامل التي تدخل في الترجمة المترجمة قرب الميتوكوندريا.

Protocol

1. الميتوكوندريا تنقية تزن بيليه من الخلايا. ويتم الحصول على ما يقرب من 0.6 غرام من 100 مل الخلايا. تنمو 100-150 مل من خلايا الخميرة إلى OD 600 = 1-1.5 في 30 ° C على وسيط النمو nonfermentable?…

Representative Results

هذا البروتوكول يسمح فصل جزء من الميتوكوندريا التي تحتوي على مكونات عصاري خلوي. أفضل طريقة لاختبار نجاحها هو إجراء تحليل الشمالية والتحليل الغربي (الشكل 1) لعينات من الخطوات عزل مختلفة. وتستمد ثلاثة معايير لجودة بمعزل عن هذه التحليلات. أولا، ما إذا كان الحمض ?…

Discussion

وكان التقدم التكنولوجي في مجال التصوير أسفرت أدوات عالية الدقة لدراسة توطين مرنا. اليوم، يمكن للمرء أن قياس حركة حتى جزيء واحد مرنا في النطاق الزمني ميللي ثانية ^23-26. حتى الآن، والنهج البيوكيميائية التقليدية، كما هو موضح أعلاه، هي أيضا غنية بالمعلومات وهي الأفض…

Materials

Yeast Extract
BactoPeptone
Galactose			Do not autoclave Galactose
Growth medium			For mitochondrial enrichment, you should use any non- fermentable carbon source, such as Galactose-based growth medium sterilized 1% Yeast Extract, 2% BactoPeptone, 2% Galactose
0.1 M TrisHCl pH9.4
30 mM TrisHCl pH7.6
Dithiothreitol (DTT)
10 mM DTT Buffer			0.1 M TrisHCl pH 9.4, 10 mM Dithiothreitol (DTT). Make fresh every time
1.2 M Sorbitol
4 mM KH2PO4
16 mM K2HPO4
0.2μm filter
Zymolyase Buffer			1.2 M Sorbitol, 4 mM KH2PO4 , 16 mM K2HPO4. Filter this  buffer (0.2μm) and keep at room temperature for future use
Zymolyase 20T			20,000 U/gr
Recovery medium			Galactose-based growth medium supplemented with 1 M Sorbitol
0.1 mg/mL Cycloheximide (CHX)
0.6 M Mannitol
5 mM MgAc
100 mM KCl
0.5 mg/mL Heparin
1 mM phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF)
Mannitol Buffer			0.6 M Mannitol, 30 mM TrisHCl pH7.6, 5 mM MgAc, 100 mM KCl. Add freshly: 0.5 mg/mL Heparin, 0.1 mg/mL CHX and 1mM (PMSF). Filter this buffer and use it ice-cold
8M Guanidinium-HCl
100% and 70% Ethanol (EtOH)
3 M Sodium Acetate pH5.2
10 M LiCl stock solution
250 mM Tris HCl pH 6.8
SDS
Glycerol
β-mercaptoethanol
Bromophenolblue
4xLSB			250 mM Tris HCl pH 6.8, 8% SDS, 40% Glycerol, 20% β-mercaptoethanol and 0.02% Bromophenol blue
Dounce homogenizer of 15-ml capacity equipped with tight- fitting pestle