ローカライズされた翻訳のメカニズムを研究するために酵母ミトコンドリアでのmRNA関連のアイソレーション
Summary
ミトコンドリアタンパク質をコードするmRNAの多くはミトコンドリア外膜に関連している。私たちは、それに関連するmRNAおよびリボソームと酵母ミトコンドリアの分離を目的とした細胞下分画の手順が記載されている。このプロトコルは、mRNAの局在化およびミトコンドリア付近の局所的な翻訳の機構を明らかにするために、多様な条件下で増殖させた細胞に適用することができる。
Abstract
ミトコンドリアタンパク質の大部分は核内にエンコードされ、細胞小器官にインポートされる必要がある。タンパク質はミトコンドリアの近くに合成されている間、輸入が発生することがあります。この可能性のサポートは、ミトコンドリアタンパク質をコードするmRNAは、多くのミトコンドリア付近に局在することが示された最近の研究に由来する。一緒に外膜とのリボソーム協会の以前のデモで、これらの結果は、局所的な翻訳プロセスを示唆している。このような局所的な変換は、輸入の効率を向上させる独自の規制部位を提供し、異所性発現の例を最小にすることができる。多様な方法には、局所的な翻訳を媒介する因子および要素を特徴付けるために使用されてきた。これらの中で標準差動遠心分離によって細胞下分画である。このプロトコルは、単一の手順でのmRNA、リボソームとタンパク質の単離できるという利点がある。これらは、次いで、種々の分子と両性によって特徴付けることができるochemical方法。さらに、トランスクリプトミクスおよびプロテオミクス法は、それによってゲノムワイドな洞察を可能にし、得られた材料に適用することができる。そのような研究のためのモデル生物としての酵母の使用は、速度、費用および単純性の利点を有する。さらに、高度な遺伝学的ツールおよび使用可能な削除株が候補因子の検証を容易にします。
Introduction
真核細胞は、特定の機能を有する個別のコンパートメントで構成されています。その機能を実現するためには、各区画には、その活性に必須であるタンパク質の固有のセットが含まれています。これらのタンパク質は、そのコンパートメントにアプローチを通して可能なメカニズムは、ローカライズ、翻訳、1,2である。このプロセスにおいて、タンパク質は、そこに配置されるリボソームおよびmRNAにより目的地に合成される。ローカライズされた翻訳の可能性の利点の中で、タンパク質のターゲティングの効率を増加したタンパク質シャペロンの必要性が減少し、サイト固有の制御機構を可能にしています。また、ローカライズされたmRNAおよびリボソームは、一般的な翻訳が阻害される細胞ストレス、例に翻訳機構の人里離れた貯水池することができます。
ミトコンドリアは、近年ではローカライズされた翻訳を研究するための中心的なモデルとなりました。ほとんどのミトコンドリアタンパク質は、核内に符号化された細胞質ゾルに翻訳され、および細胞小器官にインポート。証拠の様々な線は、これらのタンパク質の多くは局所変換プロセスを介して産生されることを示している。最初に、電子顕微鏡および生化学的分画研究は、ミトコンドリア3-5に関連したリボソームを検出しました。その後、共翻訳的に6,7にのみインポートすることが判明した特定のmRNA上の仕事によってin vivoで裏付けられ、これらの研究。ミトコンドリアでのmRNAの関連のゲノムワイドな研究では、mRNAのかなりの部分がミトコンドリア近傍8月10日に局在していることを明らかにした。これらのmRNAの一部はさらに、FISH又はMタグ9,11などのインビボ蛍光法によって特徴付けした。この関連の直接的な解釈は、これらのmRNAは、ローカライズされた翻訳のための鋳型として作用するということです。
これらのmRNAは、ミトコンドリアに接近するメカニズムは不明である。非コード領域（最もsignificantlyの3 'のUTR）はミトコンドリア12 mRNAの会合に関与することが示された。これらのドメインは、それらの輸送を媒介するRNA結合タンパク質に対する結合部位として機能する可能性がある。酵母での研究では、タンパク質のPUMファミリーのメンバー（Puf3）はミトコンドリア8,13とmRNAの関連付けをサポートしていることを明らかにした。他の家族の機能に基づいておりPuf3、もっともらしい役割は、mRNAは、ルート 14 途中である間の翻訳を抑制することである。従って、mRNAは、非コード領域と相互作用するRNA結合タンパク質によって、非翻訳状態で輸送することができる。あるいは、作業の大きな体は、タンパク質が合成されている間輸送が生じることを示唆している。特に、翻訳阻害剤は、mRNAの会合8,13に影響を与えることが示された。さらに、このようなAUGをミトコンドリア標的化配列（MTS）またはORF領域として翻訳された特徴は、局在8,11,15を補助することが示された。 HSP70ファミリータンパク質のCHミトコンドリア外膜上aperoneおよびタンパク質受容体はさらに符号化されたタンパク質の機能は、mRNAの局在16にとって重要であることを示唆し、mRNAの関連付けをサポートすることが示された。これは、リボソームタンパク質はミトコンドリア新興17へのmRNA-リボソーム-タンパク質複合体を標的化するための認識要素として機能するモデルと一致する。
ミトコンドリアの近くの局在化、翻訳電子顕微鏡（リボソームを可視化するため）3、FISH 9、（特定のmRNAを検出するための）緑色RNA 11と、生化学的分画（RNAおよびリボソームの両方を検出する）10,18を含む様々な方法によって研究された。前者の方法は、インビボでの局在を検出し、トランスポート·ダイナミクスの可視化を可能にすることができるが、後者は単一の実験で多数の異なるmRNAの検出を可能にする。さらに、生化学的分画コードまたは非コードドメインの文献である必要はありませんteredは、したがって、それらの特定の役割を評価することができる。生化学的分画は正常に多くの異なる細胞区画の単離のために、長年にわたって使用されている。そのプリンシパルと制限は十分に確立され、人は簡単に様々な目的のために既存のプロトコルを変更することができます。必要な器具類は、したがって、それは通常、細胞内局在を研究するための選択の第一の方法で、多くのラボで標準です。私たちは、リボソームがミトコンドリアに関連しているながら、mRNAの単離のために最適化されたプロトコルを記述します。このプロトコルは、したがって、ミトコンドリアの近くに局在し、翻訳に関与する因子を研究するために最適である。
Protocol
Representative Results
Discussion
画像内の科学技術の進歩は、mRNAの局在を研究するため、高解像度のツールが得られていた。今日、人はミリ秒時間スケール23-26においても単一のmRNA分子の動きを測定することができる。しかし、上述のものなどの従来の生化学的アプローチもまた、有益であり、いくつかの場合に好適である。生化学的隔離はmRNAおよびタンパク質の大きなレパートリーの精製を可能にし、従って、ゲ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、博士に感謝します。 Erezさんエリヤフ、ダニエル·メラメド、Ophry松やドロンラパポートこのプロトコルの確立中助けとコメント。この作品は、ISF（承認番号が1193年から1109年）によって資金を供給される。
Materials
| Yeast Extract | |||
| BactoPeptone | |||
| Galactose | Do not autoclave Galactose | ||
| Growth medium | For mitochondrial enrichment, you should use any non- fermentable carbon source, such as Galactose-based growth medium sterilized 1% Yeast Extract, 2% BactoPeptone, 2% Galactose | ||
| 0.1 M TrisHCl pH9.4 | |||
| 30 mM TrisHCl pH7.6 | |||
| Dithiothreitol (DTT) | |||
| 10 mM DTT Buffer | 0.1 M TrisHCl pH 9.4, 10 mM Dithiothreitol (DTT). Make fresh every time | ||
| 1.2 M Sorbitol | |||
| 4 mM KH2PO4 | |||
| 16 mM K2HPO4 | |||
| 0.2μm filter | |||
| Zymolyase Buffer | 1.2 M Sorbitol, 4 mM KH2PO4 , 16 mM K2HPO4. Filter this buffer (0.2μm) and keep at room temperature for future use | ||
| Zymolyase 20T | 20,000 U/gr | ||
| Recovery medium | Galactose-based growth medium supplemented with 1 M Sorbitol | ||
| 0.1 mg/mL Cycloheximide (CHX) | |||
| 0.6 M Mannitol | |||
| 5 mM MgAc | |||
| 100 mM KCl | |||
| 0.5 mg/mL Heparin | |||
| 1 mM phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) | |||
| Mannitol Buffer | 0.6 M Mannitol, 30 mM TrisHCl pH7.6, 5 mM MgAc, 100 mM KCl. Add freshly: 0.5 mg/mL Heparin, 0.1 mg/mL CHX and 1mM (PMSF). Filter this buffer and use it ice-cold | ||
| 8M Guanidinium-HCl | |||
| 100% and 70% Ethanol (EtOH) | |||
| 3 M Sodium Acetate pH5.2 | |||
| 10 M LiCl stock solution | |||
| 250 mM Tris HCl pH 6.8 | |||
| SDS | |||
| Glycerol | |||
| β-mercaptoethanol | |||
| Bromophenolblue | |||
| 4xLSB | 250 mM Tris HCl pH 6.8, 8% SDS, 40% Glycerol, 20% β-mercaptoethanol and 0.02% Bromophenol blue | ||
| Dounce homogenizer of 15-ml capacity equipped with tight- fitting pestle |
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