Isolamento de mRNAs Associated com mitocôndrias de levedura para estudar mecanismos de regionalização de Tradução
Summary
Muitos mRNAs que codificam as proteínas mitocondriais são associados com a membrana exterior mitocondrial. Descreve-se um processo de fracionamento subcelular que visa o isolamento de mitocôndrias de levedura com seus mRNAs e ribossomos associados. Este protocolo pode ser aplicado a células cultivadas sob diversas condições, a fim de revelar os mecanismos de localização de mRNA e tradução localizada perto das mitocôndrias.
Abstract
A maioria das proteínas mitocondriais são codificados no núcleo e precisam ser importadas para a organela. Import pode ocorrer enquanto que a proteína é sintetizada próximo da mitocôndria. O suporte para esta possibilidade é derivado de estudos recentes, em que muitos mRNAs que codificam proteínas mitocondriais foram mostrados para ser localizado para a vizinhança mitocôndria. Juntamente com as demonstrações anteriores de associação dos ribossomos com a membrana externa, estes resultados sugerem um processo de tradução localizada. Tal tradução localizada pode melhorar a eficiência de importação, fornecer locais únicos de regulação e minimizar os casos de expressão ectópica. Diversos métodos têm sido utilizados para caracterizar os elementos e elementos que medeiam a tradução localizado. Padrão entre estes é o fraccionamento subcelular por centrifugação diferencial. Este protocolo apresenta a vantagem de isolamento de ARNm, ribossomas e proteínas num único processo. Estes podem, então, ser caracterizada por vários molecular e bimétodos ochemical. Além disso, transcriptómica e proteómica métodos pode ser aplicada ao material resultante, assim, permitir percepções de todo o genoma. A utilização de leveduras como organismo-modelo para tais estudos tem as vantagens de rapidez, simplicidade e custos. Além disso, as ferramentas genéticas avançadas e estirpes de deleção disponíveis facilitar a verificação de factores candidatos.
Introduction
As células eucarióticas são organizados em compartimentos distintos que possuem funções específicas. Para cumprir a sua função, cada compartimento contém um conjunto exclusivo de proteínas que são essenciais para a sua actividade. Um possível mecanismo pelo qual estas proteínas se aproximam de seu compartimento é de 1,2 localizada tradução. Neste processo, a proteína é sintetizada no destino por ribossomas e mRNAs que são aí localizados. Entre as vantagens prováveis de tradução localizada são o aumento da eficiência do direcionamento de proteínas, diminuição da necessidade de acompanhantes de proteína, e permitindo que os mecanismos de regulação específicas do site. Além disso, mRNAs e ribossomas localizados podem ser um reservatório isolado de máquinas de tradução em casos de estresse celular, quando a tradução geral é inibida.
As mitocôndrias se tornou nos últimos anos um modelo central para estudar tradução localizada. A maioria das proteínas de mitocôndrias são codificadas no núcleo, traduzida no citoplasma,e importadas para a organela. Várias linhas de evidência indicam que muitas destas proteínas são produzidas através de um processo de tradução local. Inicialmente, os estudos de microscopia eletrônica e de fracionamento bioquímico detectado ribossomos associados mitocôndrias 3-5. Estes estudos, onde, em seguida, corroborado in vivo pelo trabalho em mRNAs específicos, que foram encontrados para ser importados em um 6,7 maneira cotranslational. Estudos genômicos de mRNAs associação com mitocôndrias revelou que uma fracção significativa dos mRNAs são localizadas na vizinhança mitocôndrias 8-10. Alguns destes mRNAs foram adicionalmente caracterizados in vivo por métodos de fluorescência, tais como peixes ou MTAG 9,11. A interpretação direta desta associação é que esses mRNAs servir como modelos para tradução localizada.
Os mecanismos pelos quais estas se aproximam dos mRNAs mitocôndrias são desconhecidas. Domínios não-codificante (mais significantly 3 'UTRs) mostraram estar envolvidas na associação de mRNA para a mitocôndria 12. Estes domínios são susceptíveis de servir como um local de ligação a proteínas de ligação a ARN que medeiam o seu transporte. Estudos em levedura revelou que um membro da família de proteínas de PUM (Puf3) apoia associação ARNm com mitocôndrias 8,13. Um papel plausível para Puf3, que se baseia em funções de outros membros da família, é para inibir a tradução do mRNA, enquanto está a caminho 14. Assim, os mRNAs podem ser transportados num estado não traduzida, por proteínas de ligação de ARN que interagem com regiões não codificantes. Alternativamente, um grande corpo de trabalho sugere que ocorre o transporte, enquanto a proteína está a ser sintetizado. Em particular, os inibidores de tradução foram mostrados para afetar mRNAs associação 8,13. Além disso, os recursos traduzidos como a agosto, a sequência de direcionamento mitocondrial (MTS) ou regiões ORF foram mostrados para ajudar na localização 8,11,15. Ch proteína Hsp70-famíliaaperone e receptor de proteína de membrana externa as mitocôndrias foram também demonstrado que suporta associação ARNm, implicando que mais características codificado em proteínas são importantes para a localização de mRNA 16. Isto é consistente com um modelo no qual a proteína-ribossoma emergente serve como elemento de reconhecimento para a segmentação complexo ribossoma-ARNm-proteína para a mitocôndria 17.
Tradução localizada perto da mitocôndria foi estudado por vários métodos, incluindo a microscopia de electrões (para visualizar ribossomas) 3, FISH 9, RNA verde (para detectar os mRNAs específicos) 11, e fraccionamento bioquímico (para detectar os níveis de RNA e ribossomas) 10,18. Enquanto os métodos anteriores detectar a localização in vivo e pode permitir a visualização dinâmica de transporte, este último permite a detecção de vários mRNAs diferentes em uma única experiência. Além disso, para codificação de fracionamento bioquímico ou não-codificantes domínios não precisa ser altrado, por conseguinte, as suas funções específicas, podem ser avaliadas. Fraccionamento bioquímico tem sido utilizado com sucesso durante muitos anos, para o isolamento de diversos compartimentos celulares diferentes. Seus princípios e limitações estão bem estabelecidos, e pode-se facilmente modificar os protocolos existentes para finalidade diferente. A instrumentação necessária é padrão em muitos laboratórios, portanto, é geralmente o primeiro método de escolha para estudar a localização intracelular. Descreve-se um protocolo que foi optimizado para o isolamento de ARNm, enquanto ribossomas estão associados com a mitocôndria. Este protocolo é, portanto, ideal para o estudo de fatores envolvidos na tradução localizada perto mitocôndria.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os avanços tecnológicos no processamento de imagens tinha rendido ferramentas de alta resolução para estudar a localização mRNA. Hoje, pode-se medir o movimento de mesmo uma única molécula de mRNA na escala de tempo ms 23-26. No entanto, as abordagens bioquímicas tradicionais, como os descritos acima, também são informativos e são preferíveis em alguns casos. Isolamento bioquímico permite a purificação de um grande reportório de ARNm e proteínas, e por isso é preferível para estudos genôm…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos drs. Erez Eliyahu, Daniel Melamed, Ophry Pines e Doron Rapaport ajuda e comentários durante o estabelecimento deste protocolo. Este trabalho é financiado pelo ISF (número de concessão 1193-1109).
Materials
| Yeast Extract | |||
| BactoPeptone | |||
| Galactose | Do not autoclave Galactose | ||
| Growth medium | For mitochondrial enrichment, you should use any non- fermentable carbon source, such as Galactose-based growth medium sterilized 1% Yeast Extract, 2% BactoPeptone, 2% Galactose | ||
| 0.1 M TrisHCl pH9.4 | |||
| 30 mM TrisHCl pH7.6 | |||
| Dithiothreitol (DTT) | |||
| 10 mM DTT Buffer | 0.1 M TrisHCl pH 9.4, 10 mM Dithiothreitol (DTT). Make fresh every time | ||
| 1.2 M Sorbitol | |||
| 4 mM KH2PO4 | |||
| 16 mM K2HPO4 | |||
| 0.2μm filter | |||
| Zymolyase Buffer | 1.2 M Sorbitol, 4 mM KH2PO4 , 16 mM K2HPO4. Filter this buffer (0.2μm) and keep at room temperature for future use | ||
| Zymolyase 20T | 20,000 U/gr | ||
| Recovery medium | Galactose-based growth medium supplemented with 1 M Sorbitol | ||
| 0.1 mg/mL Cycloheximide (CHX) | |||
| 0.6 M Mannitol | |||
| 5 mM MgAc | |||
| 100 mM KCl | |||
| 0.5 mg/mL Heparin | |||
| 1 mM phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) | |||
| Mannitol Buffer | 0.6 M Mannitol, 30 mM TrisHCl pH7.6, 5 mM MgAc, 100 mM KCl. Add freshly: 0.5 mg/mL Heparin, 0.1 mg/mL CHX and 1mM (PMSF). Filter this buffer and use it ice-cold | ||
| 8M Guanidinium-HCl | |||
| 100% and 70% Ethanol (EtOH) | |||
| 3 M Sodium Acetate pH5.2 | |||
| 10 M LiCl stock solution | |||
| 250 mM Tris HCl pH 6.8 | |||
| SDS | |||
| Glycerol | |||
| β-mercaptoethanol | |||
| Bromophenolblue | |||
| 4xLSB | 250 mM Tris HCl pH 6.8, 8% SDS, 40% Glycerol, 20% β-mercaptoethanol and 0.02% Bromophenol blue | ||
| Dounce homogenizer of 15-ml capacity equipped with tight- fitting pestle |
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