Isolatie van mRNA's geassocieerd met Gist Mitochondriën Mechanismen van Gelokaliseerde Vertaling Studie
Summary
Veel mRNAs coderend mitochondriale eiwitten zijn geassocieerd met de mitochondriën buitenmembraan. We beschrijven een subcellulaire fractionering procedure gericht op isolatie van gist mitochondriën met de bijbehorende mRNA en ribosomen. Dit protocol kan worden toegepast op cellen onder verschillende omstandigheden gekweekt om de mechanismen van mRNA lokalisatie en translatie gelokaliseerd nabij de mitochondriën onthullen.
Abstract
De meeste van mitochondriale eiwitten worden gecodeerd in de kern en moet in het organel te worden geïmporteerd. Import kunnen optreden tijdens het eiwit wordt gesynthetiseerd in de buurt van de mitochondriën. Steun voor deze mogelijkheid wordt afgeleid uit recente studies, waarin veel mRNAs coderend mitochondriale eiwitten bleken gelokaliseerd naar de mitochondriën omgeving. Samen met eerdere demonstraties van ribosomen worden betrokken bij de buitenste membraan, suggereren deze resultaten een gelokaliseerde vertaalproces. Dergelijke gelokaliseerde vertaling kan efficiëntie invoer te verbeteren, bieden unieke regelgeving sites en gevallen van ectopische expressie te minimaliseren. Diverse methoden zijn gebruikt om de factoren en elementen die gelokaliseerd vertaling bemiddelen karakteriseren. Standaard daarvan is subcellulaire fractionering door differentiële centrifugatie. Dit protocol heeft het voordeel van isolatie van mRNA, ribosomen en eiwitten in een enkele procedure. Deze kunnen dan worden gekarakteriseerd door verschillende moleculaire en biochemical methoden. Bovendien kunnen transcriptomics en proteomics methoden toegepast op de resulterende materiaal, waardoor genoom-brede inzichten mogelijk. Het gebruik van gist als modelorganisme voor dergelijke studies heeft de voordelen van snelheid, kosten en eenvoud. Bovendien is de geavanceerde genetische hulpmiddelen en beschikbare deletiestammen vergemakkelijken verificatie van kandidaat factoren.
Introduction
Eukaryote cellen zijn georganiseerd in verschillende compartimenten met specifieke functies. Om zijn functie te vervullen, elk compartiment bevat een unieke set van eiwitten die essentieel zijn voor de activiteit. Een mogelijk mechanisme waardoor deze eiwitten benaderen hun compartiment is door gelokaliseerde vertaling 1,2. In deze werkwijze wordt het eiwit gesynthetiseerd op zijn bestemming door ribosomen en mRNA dat er zich. Onder de waarschijnlijke voordelen van gelokaliseerde vertaling zijn toegenomen efficiëntie van eiwit targeting, verminderde behoefte aan eiwit begeleiders, en het mogelijk maken de site-specifieke regulatie mechanismen. Ook kunnen gelokaliseerde mRNA en ribosomen een afgelegen reservoir van de vertaling machines zijn in gevallen van cellulaire stress, wanneer de algemene vertaling wordt geremd.
Mitochondriën werd in de afgelopen jaren een centraal model om gelokaliseerde vertaling studeren. De meeste mitochondriën eiwitten worden gecodeerd in de kern vertaald in het cytosol,en geïmporteerd in het organel. Verschillende lijnen van bewijs geven aan dat veel van deze eiwitten worden via een lokale vertaalproces. Aanvankelijk elektronenmicroscopie en biochemische fractionering studies gedetecteerd ribosomen verbonden mitochondriën 3-5. Deze studies werden vervolgens bevestigd in vivo door het werk op specifieke mRNA's, die werden gevonden te worden ingevoerd in een cotranslational manier 6,7. Genoom-brede studies van mRNA associatie met mitochondria is gebleken dat een aanzienlijk deel van mRNA's zijn gelokaliseerd in de mitochondriën omgeving 8-10. Sommige van deze mRNA's werden verder gekarakteriseerd in vivo fluorescentie werkwijzen, zoals vissen of MTAG 9,11. Een straight-forward interpretatie van deze vereniging is dat deze mRNA's dienen als templates voor gelokaliseerde vertaling.
De mechanismen waarmee deze mRNAs benaderen mitochondria onbekend. Noncoding domeinen (meest significantly 3 'UTR's) bleken betrokken te zijn bij mRNA vereniging naar de mitochondriën 12. Deze domeinen zijn waarschijnlijk dienen als een bindingsplaats voor RNA-bindende eiwitten die het vervoer mediëren. Studies in gist bleek dat een lid van de PUM-familie van eiwitten (Puf3) ondersteunt mRNA associatie met mitochondriën 8,13. Een aannemelijke rol Puf3, die gebaseerd is op functies van andere familieleden, te remmen translatie terwijl de mRNA onderweg 14. Zo kan mRNA in een getranslateerde toestand worden vervoerd, door RNA bindende eiwitten die interageren met coderende regio. Als alternatief, een grote hoeveelheid werk suggereert dat het vervoer plaatsvindt, terwijl het eiwit wordt gesynthetiseerd. In het bijzonder werden remmers aangetoond dat ze mRNA vereniging 8,13. Bovendien vertaalde functies zoals het AUG mitochondriale targeting sequentie (MTS) of ORF's werden vermeld om lokalisatie 8,11,15. Hsp70-familie eiwit chaperone en proteïne receptor op de mitochondriën buitenmembraan bleken ook ondersteuning mRNA vereniging verder impliceert dat gecodeerde eiwitten zijn belangrijk voor mRNA lokalisatie 16. Dit is consistent met een model waarbij de ribosoom nieuwe eiwit dient als erkenning element voor het richten van mRNA-ribosoom-eiwitcomplex de mitochondriën 17.
Gelokaliseerde vertaling buurt van de mitochondria werd bestudeerd door verschillende methoden, met inbegrip van elektronenmicroscopie (naar ribosomen visualiseren) 3, FISH 9, groen RNA (specifieke mRNA's detecteren) 11, en biochemische fractionering (zowel RNA en ribosomen detecteren) 10,18. Terwijl de eerste werkwijzen detecteren lokalisatie in vivo en kunnen visualisatie van het dynamische mogelijk, deze maakt de ontdekking van verschillende mRNA in een enkel experiment. Verder is het voor biochemische fractionering codering of niet-coderende domeinen hoeven niet al zijntreerd, dus hun specifieke rollen kunnen worden geëvalueerd. Biochemische fractionering is met succes gebruikt voor vele jaren, voor het isoleren van verschillende cellulaire compartimenten. Haar opdrachtgevers en beperkingen zijn goed ingeburgerd, en men kan gemakkelijk bestaande protocollen voor verschillende doeleinden te wijzigen. De nodige instrumentatie is standaard in vele laboratoria, daarom is meestal de eerste methode van keuze voor het bestuderen intracellulaire lokalisatie. We beschrijven een protocol dat was geoptimaliseerd voor isolatie van mRNA terwijl ribosomen verbonden met mitochondria. Dit protocol is dus optimaal voor het bestuderen van factoren die betrokken zijn bij gelokaliseerde vertaling buurt mitochondriën.
Protocol
Representative Results
Discussion
Technologische ontwikkelingen in de beeldvorming had hoge resolutie instrumenten opgeleverd om mRNA lokalisatie studeren. Vandaag de dag kan men de beweging van zelfs een enkele mRNA-molecuul te meten op de msec tijdschaal 23-26. Toch traditionele biochemische benaderingen, als hierboven beschreven, zijn ook informatief en de voorkeur in sommige gevallen. Biochemische isolatie kan zuivering van een groot repertoire van mRNA en eiwitten, en verdient daarom de voorkeur voor genoom-breed onderzoek. In een isolat…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Drs. Erez Eliyahu, Daniel Melamed, Ophry Pines en Doron Rapaport voor hulp en commentaar tijdens de oprichting van dit protocol. Dit werk wordt gefinancierd door de ISF (licentienummer 1193-1109).
Materials
| Yeast Extract | |||
| BactoPeptone | |||
| Galactose | Do not autoclave Galactose | ||
| Growth medium | For mitochondrial enrichment, you should use any non- fermentable carbon source, such as Galactose-based growth medium sterilized 1% Yeast Extract, 2% BactoPeptone, 2% Galactose | ||
| 0.1 M TrisHCl pH9.4 | |||
| 30 mM TrisHCl pH7.6 | |||
| Dithiothreitol (DTT) | |||
| 10 mM DTT Buffer | 0.1 M TrisHCl pH 9.4, 10 mM Dithiothreitol (DTT). Make fresh every time | ||
| 1.2 M Sorbitol | |||
| 4 mM KH2PO4 | |||
| 16 mM K2HPO4 | |||
| 0.2μm filter | |||
| Zymolyase Buffer | 1.2 M Sorbitol, 4 mM KH2PO4 , 16 mM K2HPO4. Filter this buffer (0.2μm) and keep at room temperature for future use | ||
| Zymolyase 20T | 20,000 U/gr | ||
| Recovery medium | Galactose-based growth medium supplemented with 1 M Sorbitol | ||
| 0.1 mg/mL Cycloheximide (CHX) | |||
| 0.6 M Mannitol | |||
| 5 mM MgAc | |||
| 100 mM KCl | |||
| 0.5 mg/mL Heparin | |||
| 1 mM phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) | |||
| Mannitol Buffer | 0.6 M Mannitol, 30 mM TrisHCl pH7.6, 5 mM MgAc, 100 mM KCl. Add freshly: 0.5 mg/mL Heparin, 0.1 mg/mL CHX and 1mM (PMSF). Filter this buffer and use it ice-cold | ||
| 8M Guanidinium-HCl | |||
| 100% and 70% Ethanol (EtOH) | |||
| 3 M Sodium Acetate pH5.2 | |||
| 10 M LiCl stock solution | |||
| 250 mM Tris HCl pH 6.8 | |||
| SDS | |||
| Glycerol | |||
| β-mercaptoethanol | |||
| Bromophenolblue | |||
| 4xLSB | 250 mM Tris HCl pH 6.8, 8% SDS, 40% Glycerol, 20% β-mercaptoethanol and 0.02% Bromophenol blue | ||
| Dounce homogenizer of 15-ml capacity equipped with tight- fitting pestle |
References
- Holt, C. E., Bullock, S. L. Subcellular mRNA localization in animal cells and why it matters. Science. 326, 1212-1216 (2009).
- Donnelly, C. J., Fainzilber, M., Twiss, J. L. Subcellular communication through RNA transport and localized protein synthesis. Traffic. 11, 1498-1505 (2010).
- Kellems, R. E., Allison, V. F., Butow, R. A. Cytoplasmic type 80 S ribosomes associated with yeast mitochondria. II. Evidence for the association of cytoplasmic ribosomes with the outer mitochondrial membrane in situ. J. Biol. Chem. 249, 3297-3303 (1974).
- Kellems, R. E., Butow, R. A. Cytoplasmic type 80 S ribosomes associated with yeast mitochondria. 3. Changes in the amount of bound ribosomes in response to changes in metabolic state. J. Biol. Chem. 249, 3304-3310 (1974).
- Suissa, M., Schatz, G. Import of proteins into mitochondria. Translatable mRNAs for imported mitochondrial proteins are present in free as well as mitochondria-bound cytoplasmic polysomes. J. Biol. Chem. 257, 13048-13055 (1982).
- Fujiki, M., Verner, K. Coupling of cytosolic protein synthesis and mitochondrial protein import in yeast. Evidence for cotranslational import in vivo. J. Biol. Chem. 268, 1914-1920 (1993).
- Yogev, O., Karniely, S., Pines, O. Translation-coupled translocation of yeast fumarase into mitochondria in vivo. J. Biol. Chem. 282, 29222-29229 (2007).
- Eliyahu, E., et al. Tom20 mediates localization of mRNAs to mitochondria in a translation-dependent manner. Mol. Cell. Biol. 30, 284-294 (2010).
- Garcia, M., et al. Mitochondria-associated yeast mRNAs and the biogenesis of molecular complexes. Mol. Cell. Biol. 18, 362-368 (2007).
- Marc, P., et al. Genome-wide analysis of mRNAs targeted to yeast mitochondria. EMBO Rep. 3, 159-164 (2002).
- Gadir, N., Haim-Vilmovsky, L., Kraut-Cohen, J., Gerst, J. E. Localization of mRNAs coding for mitochondrial proteins in the yeast Saccharomyces cerevisiae. RNA. 17, 1551-1565 (2011).
- Margeot, A., et al. In Saccharomyces cerevisiae, ATP2 mRNA sorting to the vicinity of mitochondria is essential for respiratory function. J EMBO. 21, 6893-6904 (2002).
- Saint-Georges, Y., et al. Yeast mitochondrial biogenesis: a role for the PUF RNA-binding protein Puf3p in mRNA localization. PloS one. 3, (2008).
- Quenault, T., Lithgow, T., Traven, A. PUF proteins: repression, activation and mRNA localization. Trends Cell Biol. 21, 104-112 (2011).
- Garcia, M., Delaveau, T., Goussard, S., Jacq, C. Mitochondrial presequence and open reading frame mediate asymmetric localization of messenger RNA. EMBO Rep. 11, 285-291 (2010).
- Eliyahu, E., Lesnik, C., Arava, Y. The protein chaperone Ssa1 affects mRNA localization to the mitochondria. FEBS Lett. 586, 64-69 (2012).
- Ahmed, A. U., Fisher, P. R. Import of nuclear-encoded mitochondrial proteins: a cotranslational perspective. Int. Rev. Cell Biol. 273, 49-68 (2009).
- Eliyahu, E., Melamed, D., Arava, Y. Genome-wide analysis of RNA extracted from isolated mitochondria. Methods Mol. Biol. 714, 287-299 (2011).
- Eldad, N., Yosefzon, Y., Arava, Y. Identification and characterization of extensive intra-molecular associations between 3′-UTRs and their ORFs. Nucleic Acids RES. 36, 6728-6738 (2008).
- Melamed, D., Arava, Y. Genome-wide analysis of mRNA polysomal profiles with spotted DNA microarrays. Methods Enzymol. 431, 177-201 (2007).
- Margeot, A., et al. Why are many mRNAs translated to the vicinity of mitochondria: a role in protein complex assembly. Gene. 354, 64-71 (2005).
- Mathieu, L., Marsy, S., Saint-Georges, Y., Jacq, C., Dujardin, G. A transcriptome screen in yeast identifies a novel assembly factor for the mitochondrial complex III. Mitochondrion. 11, 391-396 (2011).
- Hocine, S., Raymond, P., Zenklusen, D., Chao, J. A., Singer, R. H. Single-molecule analysis of gene expression using two-color RNA labeling in live yeast. Nat. Methods. 10, 119-121 (2013).
- Park, H. Y., Buxbaum, A. R., Singer, R. H. Single mRNA tracking in live cells. Methods Enzymol. 472, 387-406 (2010).
- Thompson, M. A., Casolari, J. M., Badieirostami, M., Brown, P. O., Moerner, W. E. Three-dimensional tracking of single mRNA particles in Saccharomyces cerevisiae using a double-helix point spread function. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 17864-17871 (2010).
- Tyagi, S. Imaging intracellular RNA distribution and dynamics in living cells. Nat. Methods. 6, 331-338 (2009).
- Garcia, M., Darzacq, X., Devaux, F., Singer, R. H., Jacq, C. Yeast mitochondrial transcriptomics. Methods Mol. Biol. 372, 505-528 (2007).
- Reinders, J., Sickmann, A. Proteomics of yeast mitochondria. Methods Mol. Biol. 372, 543-557 (2007).
- Meisinger, C., Sommer, T., Pfanner, N. Purification of Saccharomcyes cerevisiae mitochondria devoid of microsomal and cytosolic contaminations. Anal. Biochem. 287, 339-342 (2000).
- Glick, B. S., Pon, L. A. Isolation of highly purified mitochondria from Saccharomyces cerevisiae. Methods Enzymol. 260, 213-223 (1995).
- Boldogh, I. R., Pon, L. A. Purification and subfractionation of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Methods Cell Biol. 80, 45-64 (2007).
- Rieder, S. E., Emr, S. D., Bonifacino, J. S., et al. . Isolation of subcellular fractions from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Current protocols in cell biology / editorial board. 8, (2001).
- Diekert, K., de Kroon, A. I., Kispal, G., Lill, R. Isolation and subfractionation of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Methods Cell Biol. 65, 37-51 (2001).
