स्थानीयकृत अनुवाद के तंत्र का अध्ययन करने के लिए खमीर Mitochondria साथ mRNAs एसोसिएटेड का अलगाव
Summary
Mitochondrial प्रोटीन एन्कोडिंग कई mRNAs mitochondria बाहरी झिल्ली के साथ जुड़े रहे हैं. हम उसके संबंधित mRNAs और राइबोसोम के साथ खमीर माइटोकॉन्ड्रिया के अलगाव के उद्देश्य से एक subcellular fractionation प्रक्रिया का वर्णन. इस प्रोटोकॉल mRNA स्थानीयकरण का तंत्र और mitochondria निकट स्थानीयकृत अनुवाद प्रकट करने के क्रम में विविध परिस्थितियों में विकसित कोशिकाओं के लिए लागू किया जा सकता है.
Abstract
Mitochondrial प्रोटीन की अधिकांश नाभिक में इनकोडिंग और organelle में आयात करने की आवश्यकता है. प्रोटीन mitochondria के पास संश्लेषित है जबकि आयात हो सकता है. इस संभावना के लिए समर्थन mitochondrial प्रोटीन एन्कोडिंग कई mRNAs mitochondria आसपास के क्षेत्र के लिए स्थानीय होना दिखाया गया है, जिसमें हाल ही के अध्ययन से प्राप्त होती है. साथ में बाहरी झिल्ली के साथ राइबोसोम एसोसिएशन के पूर्व प्रदर्शनों के साथ, इन परिणामों को एक स्थानीय अनुवाद प्रक्रिया का सुझाव. इस तरह स्थानीयकृत अनुवाद, आयात दक्षता में सुधार अनूठा विनियमन साइटों प्रदान और अस्थानिक अभिव्यक्ति के मामलों को कम कर सकते हैं. विविध तरीकों स्थानीयकृत अनुवाद कि मध्यस्थता और कारक तत्व चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. इनमें मानक अंतर centrifugation द्वारा subcellular fractionation है. इस प्रोटोकॉल एक ही प्रक्रिया में mRNAs, राइबोसोम और प्रोटीन के अलगाव का लाभ दिया है. ये तो विभिन्न आणविक और द्वि द्वारा होती जा सकता हैochemical तरीकों. इसके अलावा, transcriptomics और प्रोटिओमिक्स तरीकों जिससे जीनोम चौड़ा अंतर्दृष्टि की अनुमति है, जिसके परिणामस्वरूप सामग्री के लिए लागू किया जा सकता है. इस तरह के अध्ययन के लिए एक मॉडल के रूप में जीव खमीर का उपयोग गति, लागत और सादगी के फायदे हैं. इसके अलावा, उन्नत आनुवंशिक उपकरण और उपलब्ध विलोपन उपभेदों उम्मीदवार कारकों के सत्यापन की सुविधा.
Introduction
कोशिकाओं विशिष्ट कार्य होने के अलग डिब्बों में आयोजित कर रहे हैं. अपने कार्य को पूरा करने के लिए, प्रत्येक डिब्बे अपनी गतिविधि के लिए आवश्यक हैं कि प्रोटीन का एक अनूठा सेट होता है. इन प्रोटीनों उनके डिब्बे दृष्टिकोण के माध्यम से जो एक संभव तंत्र स्थानीयकृत अनुवाद 1,2 से है. इस प्रक्रिया में, प्रोटीन राइबोसोम और वहाँ स्थित हैं कि mRNAs द्वारा अपने गंतव्य पर संश्लेषित है. स्थानीयकृत अनुवाद के संभावित फायदे लक्ष्य प्रोटीन की दक्षता बढ़ रहे हैं के अलावा, प्रोटीन संरक्षिकाओं के लिए की जरूरत कम है, और साइट विशेष नियमन तंत्र को सक्षम करने. इसके अलावा, स्थानीय mRNAs और राइबोसोम जनरल अनुवाद हिचकते है जब सेलुलर तनाव के मामलों में अनुवाद मशीनरी के एक सुनसान जलाशय किया जा सकता है.
Mitochondria हाल के वर्षों में स्थानीय अनुवाद अध्ययन करने के लिए एक केंद्रीय मॉडल बन गई. अधिकांश mitochondria प्रोटीन, cytosol में अनुवादित नाभिक में इनकोडऔर organelle में आयात किया. सबूत के विभिन्न लाइनों इन प्रोटीनों की कई एक स्थानीय अनुवाद प्रक्रिया के माध्यम से उत्पादन किया जाता है कि संकेत मिलता है. प्रारंभ में, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी और जैव रासायनिक fractionation पढ़ाई mitochondria 3-5 से जुड़े राइबोसोम का पता चला. तब केवल एक cotranslational ढंग 6,7 में आयातित किया जाना पाया गया है कि विशिष्ट mRNAs, पर काम से vivo में पुष्टि की है, जहां ये अध्ययन. Mitochondria साथ mRNAs एसोसिएशन के जीनोम चौड़ा पढ़ाई mRNAs का एक महत्वपूर्ण अंश mitochondria आसपास के क्षेत्र में 8-10 के लिए स्थानीय कर रहे हैं कि पता चला. इन mRNAs से कुछ आगे ऐसी मछली या mTAG 9,11 के रूप में vivo प्रतिदीप्ति तरीकों, द्वारा विशेषता थे. इस संघ के एक सीधे आगे व्याख्या इन mRNAs स्थानीयकृत अनुवाद के लिए टेम्पलेट्स के रूप में काम करता है.
इन mRNAs mitochondria दृष्टिकोण तंत्र है जिसके द्वारा अज्ञात हैं. Noncoding डोमेन (सबसे significantlY 3 'UTRs) mitochondria से 12 mRNA संघ में शामिल होना दिखाया गया. इन डोमेन उनके परिवहन मध्यस्थता जो शाही सेना बाध्यकारी प्रोटीन के लिए एक बाध्यकारी साइट के रूप में काम करने की संभावना है. खमीर में अध्ययन प्रोटीन की पम परिवार (Puf3) के एक सदस्य mitochondria 8,13 साथ mRNA एसोसिएशन का समर्थन करता है कि पता चला. परिवार के अन्य सदस्यों के कार्यों पर आधारित है जो Puf3, के लिए एक प्रशंसनीय भूमिका, mRNA मार्ग 14 एन है जबकि अनुवाद बाधित है. इस प्रकार, mRNAs noncoding क्षेत्रों के साथ बातचीत कि शाही सेना बाध्यकारी प्रोटीन से, एक nontranslated स्थिति में ले जाया जा सकता है. वैकल्पिक रूप से, काम का एक बड़ा शरीर प्रोटीन संश्लेषित किया जा रहा है, जबकि परिवहन होता है कि पता चलता है. विशेष रूप से, अनुवाद inhibitors mRNAs एसोसिएशन 8,13 को प्रभावित करने के लिए दिखाया गया. इसके अलावा, इस तरह के अगस्त के रूप में अनुवाद सुविधाओं, mitochondrial लक्ष्यीकरण अनुक्रम (एमटीएस) या ओआरएफ क्षेत्रों स्थानीयकरण 8,11,15 में सहायता करने के लिए दिखाया गया. Hsp70 परिवार प्रोटीन चर्चाmitochondria बाहरी झिल्ली पर aperone और प्रोटीन रिसेप्टर भी आगे इनकोडिंग प्रोटीन सुविधाओं mRNA स्थानीयकरण 16 के लिए महत्वपूर्ण हैं जिसका अर्थ है कि mRNA संघ का समर्थन करने के लिए दिखाया गया. इस राइबोसोम उभरते प्रोटीन mitochondria से 17 mRNA-राइबोसोम प्रोटीन परिसर को निशाना बनाने के लिए मान्यता तत्व के रूप में कार्य करता है, जिसमें एक मॉडल के साथ संगत है.
Mitochondria के पास स्थानीयकृत अनुवाद इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (राइबोसोम कल्पना करने के लिए) 3, मछली 9, (विशिष्ट mRNAs का पता लगाने के लिए) ग्रीन आरएनए 11, और जैव रासायनिक fractionation (आरएनए और राइबोसोम दोनों का पता लगाने में) 10,18 सहित विभिन्न तरीकों से अध्ययन किया गया. पूर्व तरीकों vivo में स्थानीयकरण का पता लगाने और गतिशीलता परिवहन के दृश्य की अनुमति सकता है, बाद एक ही प्रयोग में कई अलग अलग mRNAs का पता लगाने की अनुमति देता है. इसके अलावा, जैव रासायनिक fractionation कोडिंग या noncoding डोमेन के लिए अल होने की जरूरत नहीं हैचार्टर्ड, इसलिए उनकी विशिष्ट भूमिका का मूल्यांकन किया जा सकता है. बायोकेमिकल fractionation सफलतापूर्वक कई अलग अलग सेलुलर डिब्बों के अलगाव के लिए, कई वर्षों के लिए इस्तेमाल किया गया है. उसके प्रधानाचार्यों और सीमाएं अच्छी तरह से स्थापित कर रहे हैं, और एक को आसानी से विभिन्न उद्देश्य के लिए मौजूदा प्रोटोकॉल को संशोधित कर सकते हैं. आवश्यक इंस्ट्रूमेंटेशन इसलिए यह आम तौर पर intracellular स्थानीयकरण के अध्ययन के लिए पसंद की पहली विधि है, कई प्रयोगशालाओं में मानक है. हम राइबोसोम mitochondria के साथ जुड़े रहे हैं, जबकि mRNAs का अलगाव के लिए अनुकूलित किया गया था कि एक प्रोटोकॉल का वर्णन. इस प्रोटोकॉल इसलिए mitochondria निकट स्थानीयकृत अनुवाद में शामिल कारकों के अध्ययन के लिए इष्टतम है.
Protocol
Representative Results
Discussion
इमेजिंग में तकनीकी प्रगति mRNA स्थानीयकरण का अध्ययन करने के लिए उच्च संकल्प उपकरण झुकेंगे था. आज, एक मिसे समय के पैमाने 23-26 में एक भी mRNA अणु का आंदोलन उपाय कर सकते हैं. फिर भी, परंपरागत जैव रासायनिक दृष्ट?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम डीआरएस धन्यवाद. Erez एलियाहू, डैनियल Melamed, Ophry पाइंस और इस प्रोटोकॉल की स्थापना के दौरान मदद और टिप्पणियों के लिए Doron रेपापोर्ट. इस काम ISF (अनुदान संख्या 1193-1109) द्वारा वित्त पोषित है.
Materials
| Yeast Extract | |||
| BactoPeptone | |||
| Galactose | Do not autoclave Galactose | ||
| Growth medium | For mitochondrial enrichment, you should use any non- fermentable carbon source, such as Galactose-based growth medium sterilized 1% Yeast Extract, 2% BactoPeptone, 2% Galactose | ||
| 0.1 M TrisHCl pH9.4 | |||
| 30 mM TrisHCl pH7.6 | |||
| Dithiothreitol (DTT) | |||
| 10 mM DTT Buffer | 0.1 M TrisHCl pH 9.4, 10 mM Dithiothreitol (DTT). Make fresh every time | ||
| 1.2 M Sorbitol | |||
| 4 mM KH2PO4 | |||
| 16 mM K2HPO4 | |||
| 0.2μm filter | |||
| Zymolyase Buffer | 1.2 M Sorbitol, 4 mM KH2PO4 , 16 mM K2HPO4. Filter this buffer (0.2μm) and keep at room temperature for future use | ||
| Zymolyase 20T | 20,000 U/gr | ||
| Recovery medium | Galactose-based growth medium supplemented with 1 M Sorbitol | ||
| 0.1 mg/mL Cycloheximide (CHX) | |||
| 0.6 M Mannitol | |||
| 5 mM MgAc | |||
| 100 mM KCl | |||
| 0.5 mg/mL Heparin | |||
| 1 mM phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) | |||
| Mannitol Buffer | 0.6 M Mannitol, 30 mM TrisHCl pH7.6, 5 mM MgAc, 100 mM KCl. Add freshly: 0.5 mg/mL Heparin, 0.1 mg/mL CHX and 1mM (PMSF). Filter this buffer and use it ice-cold | ||
| 8M Guanidinium-HCl | |||
| 100% and 70% Ethanol (EtOH) | |||
| 3 M Sodium Acetate pH5.2 | |||
| 10 M LiCl stock solution | |||
| 250 mM Tris HCl pH 6.8 | |||
| SDS | |||
| Glycerol | |||
| β-mercaptoethanol | |||
| Bromophenolblue | |||
| 4xLSB | 250 mM Tris HCl pH 6.8, 8% SDS, 40% Glycerol, 20% β-mercaptoethanol and 0.02% Bromophenol blue | ||
| Dounce homogenizer of 15-ml capacity equipped with tight- fitting pestle |
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