Выделение мРНК, связанных с митохондриях дрожжей для изучения механизмов локализованных перевода
Summary
Многие мРНК, кодирующих митохондриальные белки связаны с внешней мембраны митохондрий. Мы описываем субклеточную процедуру фракционирования, направленную на изоляцию митохондриях дрожжей и связанные с ним мРНК и рибосом. Этот протокол может быть применен к клеток, выращенных в разнообразных условиях с целью выявления механизмов локализации мРНК и локализованный перевод около митохондрий.
Abstract
Большинство митохондриальных белков закодированы в ядре и должны быть импортированы в органеллы. Импорт может произойти в то время как белок синтезируется около митохондрий. Поддержка этой возможности является производным от недавних исследований, в которых были показаны многие мРНК, кодирующие митохондриальные белки, которые будут локализованы в митохондриях близости. Вместе с ранее демонстраций ассоциации рибосомы "с наружной мембраны, эти результаты предполагают, локализованный процесс перевода. Такие локализованные перевод может повысить эффективность импорта, обеспечить уникальные сайты регулирования и минимизировать случаи эктопической экспрессии. Различные методы были использованы, чтобы охарактеризовать факторы и элементы, которые опосредуют локализованного перевода. Стандартный среди них внутриклеточного фракционирования дифференциальным центрифугированием. Этот протокол имеет преимущество изоляции мРНК, рибосом и белков в одной процедуры. Они могут характеризоваться различными молекулярными и Biрадиохимический методы. Кроме того, транскриптомику и протеомики методы могут быть применены к полученного материала, тем самым позволяют генома Insights. Использование дрожжей в качестве модельного организма для таких исследований имеет преимущества скорости, расходов и простоты. Кроме того, передовые генетические инструменты и доступные штаммы удаления облегчить проверку факторов кандидатов.
Introduction
Эукариотические клетки организованы в различных отсеках, имеющих определенные функции. Чтобы выполнить свою функцию, каждый отсек содержит уникальный набор белков, которые необходимы для его деятельности. Возможным механизмом, посредством которого эти белки подходят к своей отсек является локализованной перевода 1,2. В этом процессе, белок синтезируется в пункт назначения по рибосом и мРНК, которые расположены там. Среди несомненных преимуществ локализованного перевода увеличивается эффективность таргетинга белка, уменьшается потребность в белковых сопровождающих, и позволяет механизмы регулирования по каждому конкретному объекту. Кроме того, локализованные мРНК и рибосомы могут быть уединенный резервуар перевода машин в случаях клеточного стресса, когда вообще перевод тормозится.
Митохондрии стал в последние годы центральным моделью для изучения локализованных перевод. Большинство митохондрии белки кодируются в ядре, переведенной в цитозоле,и импортируются в органеллы. Различные линии доказательств указывают, что многие из этих белков производятся через локальную процессе перевода. Изначально электронная микроскопия и биохимические фракционирования исследования обнаружены рибосомы, связанные с митохондрий 3-5. Эти исследования, где затем подтверждено в естественных условиях работы по конкретным мРНК, которые были найдены, которые будут импортироваться только в cotranslational образом 6,7. Генома исследования мРНК ассоциации с митохондриях показали, что значительная часть мРНК локализованы в митохондриях вблизи 8-10. Некоторые из этих мРНК были дополнительно характеризуется ин виво флуоресценции методов, таких как рыба или Мечел Трейдинг АГ 9,11. Прямо вперед интерпретация этого объединения является то, что эти мРНК служить в качестве шаблонов для локализованной перевода.
Механизмы, с помощью которых эти мРНК подойти к митохондрии неизвестны. Некодирующие домены (наиболее significantlу 3'-НТО) было показано, что участие в мРНК ассоциации в митохондрии 12. Эти домены, скорее всего, чтобы служить в качестве сайта связывания с РНК-связывающих белков, которые опосредуют их транспорт. Исследования на дрожжах показали, что член PUM семейства белков (Puf3) поддерживает мРНК ассоциацию с митохондриями 8,13. Правдоподобным роль Puf3, которая основана на функциях других членов семьи, является ингибирование перевод в то время как мРНК находится в пути 14. Таким образом, мРНК могут перевозиться в нетранслируемой статуса, РНК-связывающих белков, которые взаимодействуют с некодирующих регионах. Кроме того, большой объем работы предполагает, что перенос осуществляется в то время как белок синтезируется. В частности, ингибиторы перевод показали повлиять мРНК ассоциацию 8,13. Кроме того, переведенные функции, такие как август, митохондриальная последовательность таргетинг (МТС) или ORF регионы были показаны для оказания помощи в локализации 8,11,15. Белок ч Hsp70-семьяaperone и белок рецептора на внешней мембраны митохондрий также показали поддерживать связь мРНК, далее означает, что характеристики закодированный-белковые важны для локализации мРНК 16. Это согласуется с моделью, согласно которой рибосома возникающие белок служит в качестве элемента распознавания для ориентации мРНК-рибосома-белкового комплекса в митохондрии 17.
Локализованная перевод вблизи митохондрий изучали с помощью различных методов, в том числе электронной микроскопии (визуализировать рибосомы) 3, рыба 9, зеленый РНК (выявления конкретных мРНК) 11, и биохимической фракционирования (для обнаружения как РНК, так и рибосом) 10,18. В то время как прежние методы обнаружения локализации в естественных условиях и может позволить визуализацию динамики транспортных, последний позволяет обнаруживать множество различных мРНК в одном эксперименте. Кроме того, для биохимического фракционирование кодирования или некодирующих областей не должны быть др.убито, поэтому их конкретные роли могут быть оценены. Биохимический фракционирование успешно используется на протяжении многих лет, для изоляции различных клеточных отсеках. Ее принципы и ограничения, хорошо известны, и можно легко изменять существующие протоколы для различных целей. Необходимая аппаратура является стандартом во многих лабораториях, поэтому, как правило, первым методом выбора для изучения внутриклеточную локализацию. Опишем протокол, который был оптимизирован для выделения мРНК в то время как рибосомы связаны с митохондрий. Этот протокол является поэтому оптимальным для изучения факторов, участвующих в локализованной перевода ближайшее митохондрий.
Protocol
Representative Results
Discussion
Технологические достижения в визуализации уступил инструменты с высоким разрешением для изучения локализации мРНК. Сегодня можно измерить движение даже одной молекулы мРНК в мс масштабе времени 23-26. Тем не менее, традиционные биохимические методы, как описана выше, также информ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим доктора. Эрез Элиягу, Даниэль Меламед, Ophry Сосны и Дорон Рапапорт за помощью и комментарии во время создания этого протокола. Эта работа финансируется ISF (грант № 1193/09).
Materials
| Yeast Extract | |||
| BactoPeptone | |||
| Galactose | Do not autoclave Galactose | ||
| Growth medium | For mitochondrial enrichment, you should use any non- fermentable carbon source, such as Galactose-based growth medium sterilized 1% Yeast Extract, 2% BactoPeptone, 2% Galactose | ||
| 0.1 M TrisHCl pH9.4 | |||
| 30 mM TrisHCl pH7.6 | |||
| Dithiothreitol (DTT) | |||
| 10 mM DTT Buffer | 0.1 M TrisHCl pH 9.4, 10 mM Dithiothreitol (DTT). Make fresh every time | ||
| 1.2 M Sorbitol | |||
| 4 mM KH2PO4 | |||
| 16 mM K2HPO4 | |||
| 0.2μm filter | |||
| Zymolyase Buffer | 1.2 M Sorbitol, 4 mM KH2PO4 , 16 mM K2HPO4. Filter this buffer (0.2μm) and keep at room temperature for future use | ||
| Zymolyase 20T | 20,000 U/gr | ||
| Recovery medium | Galactose-based growth medium supplemented with 1 M Sorbitol | ||
| 0.1 mg/mL Cycloheximide (CHX) | |||
| 0.6 M Mannitol | |||
| 5 mM MgAc | |||
| 100 mM KCl | |||
| 0.5 mg/mL Heparin | |||
| 1 mM phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) | |||
| Mannitol Buffer | 0.6 M Mannitol, 30 mM TrisHCl pH7.6, 5 mM MgAc, 100 mM KCl. Add freshly: 0.5 mg/mL Heparin, 0.1 mg/mL CHX and 1mM (PMSF). Filter this buffer and use it ice-cold | ||
| 8M Guanidinium-HCl | |||
| 100% and 70% Ethanol (EtOH) | |||
| 3 M Sodium Acetate pH5.2 | |||
| 10 M LiCl stock solution | |||
| 250 mM Tris HCl pH 6.8 | |||
| SDS | |||
| Glycerol | |||
| β-mercaptoethanol | |||
| Bromophenolblue | |||
| 4xLSB | 250 mM Tris HCl pH 6.8, 8% SDS, 40% Glycerol, 20% β-mercaptoethanol and 0.02% Bromophenol blue | ||
| Dounce homogenizer of 15-ml capacity equipped with tight- fitting pestle |
References
- Holt, C. E., Bullock, S. L. Subcellular mRNA localization in animal cells and why it matters. Science. 326, 1212-1216 (2009).
- Donnelly, C. J., Fainzilber, M., Twiss, J. L. Subcellular communication through RNA transport and localized protein synthesis. Traffic. 11, 1498-1505 (2010).
- Kellems, R. E., Allison, V. F., Butow, R. A. Cytoplasmic type 80 S ribosomes associated with yeast mitochondria. II. Evidence for the association of cytoplasmic ribosomes with the outer mitochondrial membrane in situ. J. Biol. Chem. 249, 3297-3303 (1974).
- Kellems, R. E., Butow, R. A. Cytoplasmic type 80 S ribosomes associated with yeast mitochondria. 3. Changes in the amount of bound ribosomes in response to changes in metabolic state. J. Biol. Chem. 249, 3304-3310 (1974).
- Suissa, M., Schatz, G. Import of proteins into mitochondria. Translatable mRNAs for imported mitochondrial proteins are present in free as well as mitochondria-bound cytoplasmic polysomes. J. Biol. Chem. 257, 13048-13055 (1982).
- Fujiki, M., Verner, K. Coupling of cytosolic protein synthesis and mitochondrial protein import in yeast. Evidence for cotranslational import in vivo. J. Biol. Chem. 268, 1914-1920 (1993).
- Yogev, O., Karniely, S., Pines, O. Translation-coupled translocation of yeast fumarase into mitochondria in vivo. J. Biol. Chem. 282, 29222-29229 (2007).
- Eliyahu, E., et al. Tom20 mediates localization of mRNAs to mitochondria in a translation-dependent manner. Mol. Cell. Biol. 30, 284-294 (2010).
- Garcia, M., et al. Mitochondria-associated yeast mRNAs and the biogenesis of molecular complexes. Mol. Cell. Biol. 18, 362-368 (2007).
- Marc, P., et al. Genome-wide analysis of mRNAs targeted to yeast mitochondria. EMBO Rep. 3, 159-164 (2002).
- Gadir, N., Haim-Vilmovsky, L., Kraut-Cohen, J., Gerst, J. E. Localization of mRNAs coding for mitochondrial proteins in the yeast Saccharomyces cerevisiae. RNA. 17, 1551-1565 (2011).
- Margeot, A., et al. In Saccharomyces cerevisiae, ATP2 mRNA sorting to the vicinity of mitochondria is essential for respiratory function. J EMBO. 21, 6893-6904 (2002).
- Saint-Georges, Y., et al. Yeast mitochondrial biogenesis: a role for the PUF RNA-binding protein Puf3p in mRNA localization. PloS one. 3, (2008).
- Quenault, T., Lithgow, T., Traven, A. PUF proteins: repression, activation and mRNA localization. Trends Cell Biol. 21, 104-112 (2011).
- Garcia, M., Delaveau, T., Goussard, S., Jacq, C. Mitochondrial presequence and open reading frame mediate asymmetric localization of messenger RNA. EMBO Rep. 11, 285-291 (2010).
- Eliyahu, E., Lesnik, C., Arava, Y. The protein chaperone Ssa1 affects mRNA localization to the mitochondria. FEBS Lett. 586, 64-69 (2012).
- Ahmed, A. U., Fisher, P. R. Import of nuclear-encoded mitochondrial proteins: a cotranslational perspective. Int. Rev. Cell Biol. 273, 49-68 (2009).
- Eliyahu, E., Melamed, D., Arava, Y. Genome-wide analysis of RNA extracted from isolated mitochondria. Methods Mol. Biol. 714, 287-299 (2011).
- Eldad, N., Yosefzon, Y., Arava, Y. Identification and characterization of extensive intra-molecular associations between 3′-UTRs and their ORFs. Nucleic Acids RES. 36, 6728-6738 (2008).
- Melamed, D., Arava, Y. Genome-wide analysis of mRNA polysomal profiles with spotted DNA microarrays. Methods Enzymol. 431, 177-201 (2007).
- Margeot, A., et al. Why are many mRNAs translated to the vicinity of mitochondria: a role in protein complex assembly. Gene. 354, 64-71 (2005).
- Mathieu, L., Marsy, S., Saint-Georges, Y., Jacq, C., Dujardin, G. A transcriptome screen in yeast identifies a novel assembly factor for the mitochondrial complex III. Mitochondrion. 11, 391-396 (2011).
- Hocine, S., Raymond, P., Zenklusen, D., Chao, J. A., Singer, R. H. Single-molecule analysis of gene expression using two-color RNA labeling in live yeast. Nat. Methods. 10, 119-121 (2013).
- Park, H. Y., Buxbaum, A. R., Singer, R. H. Single mRNA tracking in live cells. Methods Enzymol. 472, 387-406 (2010).
- Thompson, M. A., Casolari, J. M., Badieirostami, M., Brown, P. O., Moerner, W. E. Three-dimensional tracking of single mRNA particles in Saccharomyces cerevisiae using a double-helix point spread function. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 17864-17871 (2010).
- Tyagi, S. Imaging intracellular RNA distribution and dynamics in living cells. Nat. Methods. 6, 331-338 (2009).
- Garcia, M., Darzacq, X., Devaux, F., Singer, R. H., Jacq, C. Yeast mitochondrial transcriptomics. Methods Mol. Biol. 372, 505-528 (2007).
- Reinders, J., Sickmann, A. Proteomics of yeast mitochondria. Methods Mol. Biol. 372, 543-557 (2007).
- Meisinger, C., Sommer, T., Pfanner, N. Purification of Saccharomcyes cerevisiae mitochondria devoid of microsomal and cytosolic contaminations. Anal. Biochem. 287, 339-342 (2000).
- Glick, B. S., Pon, L. A. Isolation of highly purified mitochondria from Saccharomyces cerevisiae. Methods Enzymol. 260, 213-223 (1995).
- Boldogh, I. R., Pon, L. A. Purification and subfractionation of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Methods Cell Biol. 80, 45-64 (2007).
- Rieder, S. E., Emr, S. D., Bonifacino, J. S., et al. . Isolation of subcellular fractions from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Current protocols in cell biology / editorial board. 8, (2001).
- Diekert, K., de Kroon, A. I., Kispal, G., Lill, R. Isolation and subfractionation of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Methods Cell Biol. 65, 37-51 (2001).
