Isolering af mRNA'er associeret med Gær Mitokondrier at studere Mekanismer af lokaliserede Oversættelse
Summary
Mange mRNA'er koder mitokondrielle proteiner er associeret med mitochondrier ydre membran. Vi beskriver en subcellulær fraktionering procedure med henblik på isolering af gær mitokondrier med tilhørende mRNA'er og ribosomer. Denne protokol kan anvendes på celler dyrket under forskellige betingelser for at afsløre mekanismer mRNA lokalisering og lokaliseret oversættelse nær mitokondrierne.
Abstract
De fleste af mitokondrielle proteiner er kodet i kernen og skal importeres til organel. Import kan forekomme, mens proteinet er syntetiseret nær mitokondrier. Støtte til denne mulighed er afledt fra de seneste undersøgelser, hvor mange mRNAer koder for mitokondrielle proteiner viste sig at være lokaliseret til mitokondrierne nærhed. Sammen med tidligere demonstrationer af ribosomer associering den ydre membran, tyder disse resultater på en lokaliseret oversættelsesprocessen. Sådanne lokaliseret oversættelse kan forbedre import effektivitet, giver unikke regulering sites og minimere tilfælde af ektopisk udtryk. Forskellige metoder er blevet brugt til at karakterisere de faktorer og elementer, der medierer lokaliseret oversættelse. Standard blandt disse er subcellulær fraktionering ved differential centrifugering. Denne protokol har den fordel, at isolation af mRNAs, ribosomer og proteiner i en enkelt procedure. Disse kan så være præget af forskellige molekylære og biochemical metoder. Desuden kan anvendes transcriptomics og proteomics metoder til den resulterende materiale, og derved tillade genom-dækkende indsigt. Udnyttelsen af gær som en model organisme til sådanne undersøgelser har fordele af hastighed, omkostninger og enkelhed. Desuden avancerede genetiske værktøjer og tilgængelige deletionsstammer muliggøre kontrol af kandidat faktorer.
Introduction
Eukaryote celler er organiseret i adskilte rum med specifikke funktioner. For at opnå funktion, hvert rum indeholder et unikt sæt af proteiner, der er afgørende for dets aktivitet. En mulig mekanisme, hvorigennem disse proteiner nærmer deres rum er ved lokaliseret oversættelse 1,2. I denne proces proteinet syntetiseres på bestemmelsesstedet ved ribosomer og mRNA'er, der er placeret der. Blandt de sandsynlige fordele ved lokaliseret oversættelse øges effektiviteten af målretning protein, nedsat behov for protein chaperones og aktivering stedspecifikke reguleringsmekanismer. Desuden kan lokaliserede mRNAs og ribosomer være en afsondret reservoir oversættelse maskiner i tilfælde af cellulært stress, når generel oversættelse er spærret.
Mitokondrier blev i de senere år et centralt model til at studere lokaliseret oversættelse. De fleste mitokondrier proteiner er kodet i kernen, oversat i cytosolen,og importeres til organel. Forskellige former for evidens tyder på, at mange af disse proteiner er produceret gennem en lokal oversættelse proces. I første omgang, elektronmikroskopi og biokemisk fraktionering undersøgelser påvist ribosomer associeret med mitochondrier 3-5. Disse undersøgelser, hvor så underbygges in vivo ved arbejde på specifikke mRNA'er, der blev anset for at kun indføres i en cotranslational måde 6,7. Genom-dækkende undersøgelser af mRNAer forbindelse med mitochondrier afslørede, at en betydelig del af mRNA'er lokaliseret til mitokondrierne nærhed 8-10. Nogle af disse mRNA'er blev yderligere karakteriseret ved in vivo fluorescens metoder, såsom fisk eller mTAG 9,11. En straight-forward fortolkning af denne forening er, at disse mRNA'eme tjener som skabeloner for lokaliseret oversættelse.
De mekanismer, som disse mRNAs nærmer mitokondrier er ukendte. Ikke-kodende områder (mest significantly 3 'UTR'er) blev vist at være involveret i mRNA association til mitokondrierne 12. Disse domæner er tilbøjelige til at tjene som et bindingssted til RNA-bindende proteiner, som medierer transporten. Studier i gær afslørede, at et medlem af PUM familie af proteiner (Puf3) støtter mRNA forening med mitokondrier 8,13. En plausibel rolle for Puf3, som er baseret på funktioner af andre familiemedlemmer, er at hæmme translation mens mRNA er på vej 14. Således kan mRNA'er transporteres i en ikke-translateret status af RNA-bindende proteiner, som interagerer med ikke-kodende regioner. Alternativt kan en stor mængde arbejde tyder på, at transporten sker, mens proteinet syntetiseres. Især blev translationsinhibitorer vist sig at påvirke mRNA'er forening 8,13. Desuden oversatte funktioner såsom AUG, mitokondrie-targeting sekvens (MTS), eller ORF regioner viste sig at hjælpe med lokalisering 8,11,15. Hsp70-familien protein chaperone og protein receptor på mitokondrier ydre membran blev også vist at støtte mRNA forening yderligere indebærer, at kodet-protein funktioner er vigtige for mRNA-lokalisering 16. Dette er i overensstemmelse med en model, hvor ribosomet-spirende protein fungerer som anerkendelse element for at målrette mRNA-ribosom-protein-komplekset til mitokondrierne 17.
Lokaliseret oversættelse nær mitokondrier blev undersøgt ved forskellige metoder, herunder elektronmikroskopi (for at visualisere ribosomer) 3, FISH 9, grøn RNA (til påvisning af specifikke mRNA'er) 11, og biokemisk fraktionering (til påvisning af både RNA og ribosomer) 10,18. Mens de tidligere metoder til påvisning af lokalisering in vivo og kan tillade visualisering af transport dynamik, hvor sidstnævnte muliggør påvisning af mange forskellige mRNA'er i et enkelt eksperiment. Desuden har til biokemisk fraktionering kodende eller ikke-kodende domæner behøver ikke at være alstreret, derfor deres specifikke roller kan evalueres. Biokemiske fraktionering held har været anvendt i mange år, til isolering af mange forskellige cellulære rum. Dets opdragsgivere og begrænsninger er veletablerede, og man kan nemt modificere eksisterende protokoller til forskellige formål. Den nødvendige instrumentering er standard i mange laboratorier, er det derfor sædvanligvis den første foretrukne metode til at studere intracellulær lokalisering. Vi beskriver en protokol, der er optimeret til isolering af mRNAs mens ribosomer er forbundet med mitokondrier. Denne protokol er derfor optimal til at studere faktorer involveret i lokaliserede oversættelse nær mitokondrier.
Protocol
Representative Results
Discussion
Teknologiske fremskridt i billedbehandling havde givet høj opløsning værktøjer til at studere mRNA lokalisering. I dag kan man måle bevægelsen af selv en enkelt mRNA-molekyle på den msek tidsskala 23-26. Men traditionelle biokemiske metoder, som er beskrevet ovenfor, er også informativ og er at foretrække i nogle tilfælde. Biokemisk isolering tillader oprensning af et stort repertoire af mRNA'er og proteiner, og er derfor at foretrække for genom-dækkende studier. I et enkelt isoleret, kan man …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Drs. Erez Eliyahu, Daniel Melamed, Ophry Pines og Doron Rapaport om hjælp og kommentarer under etableringen af denne protokol. Dette arbejde er finansieret af ISF (tilskud nr. 1193-1109).
Materials
| Yeast Extract | |||
| BactoPeptone | |||
| Galactose | Do not autoclave Galactose | ||
| Growth medium | For mitochondrial enrichment, you should use any non- fermentable carbon source, such as Galactose-based growth medium sterilized 1% Yeast Extract, 2% BactoPeptone, 2% Galactose | ||
| 0.1 M TrisHCl pH9.4 | |||
| 30 mM TrisHCl pH7.6 | |||
| Dithiothreitol (DTT) | |||
| 10 mM DTT Buffer | 0.1 M TrisHCl pH 9.4, 10 mM Dithiothreitol (DTT). Make fresh every time | ||
| 1.2 M Sorbitol | |||
| 4 mM KH2PO4 | |||
| 16 mM K2HPO4 | |||
| 0.2μm filter | |||
| Zymolyase Buffer | 1.2 M Sorbitol, 4 mM KH2PO4 , 16 mM K2HPO4. Filter this buffer (0.2μm) and keep at room temperature for future use | ||
| Zymolyase 20T | 20,000 U/gr | ||
| Recovery medium | Galactose-based growth medium supplemented with 1 M Sorbitol | ||
| 0.1 mg/mL Cycloheximide (CHX) | |||
| 0.6 M Mannitol | |||
| 5 mM MgAc | |||
| 100 mM KCl | |||
| 0.5 mg/mL Heparin | |||
| 1 mM phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) | |||
| Mannitol Buffer | 0.6 M Mannitol, 30 mM TrisHCl pH7.6, 5 mM MgAc, 100 mM KCl. Add freshly: 0.5 mg/mL Heparin, 0.1 mg/mL CHX and 1mM (PMSF). Filter this buffer and use it ice-cold | ||
| 8M Guanidinium-HCl | |||
| 100% and 70% Ethanol (EtOH) | |||
| 3 M Sodium Acetate pH5.2 | |||
| 10 M LiCl stock solution | |||
| 250 mM Tris HCl pH 6.8 | |||
| SDS | |||
| Glycerol | |||
| β-mercaptoethanol | |||
| Bromophenolblue | |||
| 4xLSB | 250 mM Tris HCl pH 6.8, 8% SDS, 40% Glycerol, 20% β-mercaptoethanol and 0.02% Bromophenol blue | ||
| Dounce homogenizer of 15-ml capacity equipped with tight- fitting pestle |
References
- Holt, C. E., Bullock, S. L. Subcellular mRNA localization in animal cells and why it matters. Science. 326, 1212-1216 (2009).
- Donnelly, C. J., Fainzilber, M., Twiss, J. L. Subcellular communication through RNA transport and localized protein synthesis. Traffic. 11, 1498-1505 (2010).
- Kellems, R. E., Allison, V. F., Butow, R. A. Cytoplasmic type 80 S ribosomes associated with yeast mitochondria. II. Evidence for the association of cytoplasmic ribosomes with the outer mitochondrial membrane in situ. J. Biol. Chem. 249, 3297-3303 (1974).
- Kellems, R. E., Butow, R. A. Cytoplasmic type 80 S ribosomes associated with yeast mitochondria. 3. Changes in the amount of bound ribosomes in response to changes in metabolic state. J. Biol. Chem. 249, 3304-3310 (1974).
- Suissa, M., Schatz, G. Import of proteins into mitochondria. Translatable mRNAs for imported mitochondrial proteins are present in free as well as mitochondria-bound cytoplasmic polysomes. J. Biol. Chem. 257, 13048-13055 (1982).
- Fujiki, M., Verner, K. Coupling of cytosolic protein synthesis and mitochondrial protein import in yeast. Evidence for cotranslational import in vivo. J. Biol. Chem. 268, 1914-1920 (1993).
- Yogev, O., Karniely, S., Pines, O. Translation-coupled translocation of yeast fumarase into mitochondria in vivo. J. Biol. Chem. 282, 29222-29229 (2007).
- Eliyahu, E., et al. Tom20 mediates localization of mRNAs to mitochondria in a translation-dependent manner. Mol. Cell. Biol. 30, 284-294 (2010).
- Garcia, M., et al. Mitochondria-associated yeast mRNAs and the biogenesis of molecular complexes. Mol. Cell. Biol. 18, 362-368 (2007).
- Marc, P., et al. Genome-wide analysis of mRNAs targeted to yeast mitochondria. EMBO Rep. 3, 159-164 (2002).
- Gadir, N., Haim-Vilmovsky, L., Kraut-Cohen, J., Gerst, J. E. Localization of mRNAs coding for mitochondrial proteins in the yeast Saccharomyces cerevisiae. RNA. 17, 1551-1565 (2011).
- Margeot, A., et al. In Saccharomyces cerevisiae, ATP2 mRNA sorting to the vicinity of mitochondria is essential for respiratory function. J EMBO. 21, 6893-6904 (2002).
- Saint-Georges, Y., et al. Yeast mitochondrial biogenesis: a role for the PUF RNA-binding protein Puf3p in mRNA localization. PloS one. 3, (2008).
- Quenault, T., Lithgow, T., Traven, A. PUF proteins: repression, activation and mRNA localization. Trends Cell Biol. 21, 104-112 (2011).
- Garcia, M., Delaveau, T., Goussard, S., Jacq, C. Mitochondrial presequence and open reading frame mediate asymmetric localization of messenger RNA. EMBO Rep. 11, 285-291 (2010).
- Eliyahu, E., Lesnik, C., Arava, Y. The protein chaperone Ssa1 affects mRNA localization to the mitochondria. FEBS Lett. 586, 64-69 (2012).
- Ahmed, A. U., Fisher, P. R. Import of nuclear-encoded mitochondrial proteins: a cotranslational perspective. Int. Rev. Cell Biol. 273, 49-68 (2009).
- Eliyahu, E., Melamed, D., Arava, Y. Genome-wide analysis of RNA extracted from isolated mitochondria. Methods Mol. Biol. 714, 287-299 (2011).
- Eldad, N., Yosefzon, Y., Arava, Y. Identification and characterization of extensive intra-molecular associations between 3′-UTRs and their ORFs. Nucleic Acids RES. 36, 6728-6738 (2008).
- Melamed, D., Arava, Y. Genome-wide analysis of mRNA polysomal profiles with spotted DNA microarrays. Methods Enzymol. 431, 177-201 (2007).
- Margeot, A., et al. Why are many mRNAs translated to the vicinity of mitochondria: a role in protein complex assembly. Gene. 354, 64-71 (2005).
- Mathieu, L., Marsy, S., Saint-Georges, Y., Jacq, C., Dujardin, G. A transcriptome screen in yeast identifies a novel assembly factor for the mitochondrial complex III. Mitochondrion. 11, 391-396 (2011).
- Hocine, S., Raymond, P., Zenklusen, D., Chao, J. A., Singer, R. H. Single-molecule analysis of gene expression using two-color RNA labeling in live yeast. Nat. Methods. 10, 119-121 (2013).
- Park, H. Y., Buxbaum, A. R., Singer, R. H. Single mRNA tracking in live cells. Methods Enzymol. 472, 387-406 (2010).
- Thompson, M. A., Casolari, J. M., Badieirostami, M., Brown, P. O., Moerner, W. E. Three-dimensional tracking of single mRNA particles in Saccharomyces cerevisiae using a double-helix point spread function. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 17864-17871 (2010).
- Tyagi, S. Imaging intracellular RNA distribution and dynamics in living cells. Nat. Methods. 6, 331-338 (2009).
- Garcia, M., Darzacq, X., Devaux, F., Singer, R. H., Jacq, C. Yeast mitochondrial transcriptomics. Methods Mol. Biol. 372, 505-528 (2007).
- Reinders, J., Sickmann, A. Proteomics of yeast mitochondria. Methods Mol. Biol. 372, 543-557 (2007).
- Meisinger, C., Sommer, T., Pfanner, N. Purification of Saccharomcyes cerevisiae mitochondria devoid of microsomal and cytosolic contaminations. Anal. Biochem. 287, 339-342 (2000).
- Glick, B. S., Pon, L. A. Isolation of highly purified mitochondria from Saccharomyces cerevisiae. Methods Enzymol. 260, 213-223 (1995).
- Boldogh, I. R., Pon, L. A. Purification and subfractionation of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Methods Cell Biol. 80, 45-64 (2007).
- Rieder, S. E., Emr, S. D., Bonifacino, J. S., et al. . Isolation of subcellular fractions from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Current protocols in cell biology / editorial board. 8, (2001).
- Diekert, K., de Kroon, A. I., Kispal, G., Lill, R. Isolation and subfractionation of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Methods Cell Biol. 65, 37-51 (2001).
