Ontwikkelen biotinylatable fusie-eiwitten heeft veel potentiële toepassingen in diverse gebieden van onderzoek. Recombinant eiwit-engineering is een rechttoe rechtaan procedure die is kosteneffectief, het verstrekken van hoge opbrengsten van op maat gemaakte eiwitten.
Recombinant eiwit-engineering heeft gebruikt Escherichia coli (E. coli) expressie systemen voor bijna 4 decennia, en vandaag E. coli is nog steeds de meest gebruikte gastheerorganisme. De flexibiliteit van het systeem maakt de toevoeging van groepen zoals een biotine-tag (voor streptavidine interacties) en grotere functionele eiwitten zoals groen fluorescerend eiwit of kersen rode eiwit. Ook is de integratie van natuurlijke aminozuren zoals metaalion chelatoren, unieke reactieve functionele groepen, spectroscopische probes, en moleculen verlenen posttranslationele modificaties betere manipulatie van eiwitten eigenschappen en functionaliteiten ingeschakeld. Als gevolg van deze techniek creëert aanpasbare fusie-eiwitten die belangrijke hulpprogramma voor verschillende terreinen van onderzoek aan te bieden. Meer specifiek heeft de biotinylatable eiwitsequentie opgenomen in vele doeleiwitten vanwege de hoge affiniteit interactie tussen biotine met avidine en streptavidine. Deze toevoeging heeft geholpen bij het verbeteren van de detectie en zuivering van gemerkte eiwitten en opent de weg voor secundaire toepassingen zoals celsortering. Aldus biotine gelabelde moleculen vertonen een toenemend en wijdverspreide invloed bioindustrial en biomedische gebieden. Voor het doel van ons onderzoek hebben wij recombinante fusieproteïnen die gebiotinyleerde zenuwgroeifactor (NGF) en semaphorin3A (Sema3A) functionele regio ontworpen. We hebben eerder gemeld hoe deze gebiotinyleerde fusie-eiwitten samen met andere actieve eiwitsequenties kunnen worden vastgebonden aan biomaterialen voor tissue engineering en regeneratieve doeleinden. Dit protocol beschrijft de basisprincipes van de techniek biotinylatable eiwitten op de milligram schaal, met behulp van een T7 lac induceerbare vector en E. coli expressie gastheren, vanaf transformatie naar schaal-en zuivering.
Eiwitten omvatten een breed scala van biomoleculen die verantwoordelijk zijn voor vele biologische functies, uiteindelijk leidend tot goede vorming en organisatie weefsel. Deze moleculen initiëren duizenden signaalwegen die de controle up-regulatie en / of down-regulatie van genen en andere eiwitten, een evenwicht te bewaren in het menselijk lichaam. Verstoring van een enkel eiwit beïnvloedt dit hele web van signalen, wat kan leiden tot het ontstaan van verwoestende aandoeningen of ziekten. Engineering van afzonderlijke eiwitten in het lab biedt een oplossing voor de bestrijding van deze bijwerkingen en biedt een alternatief voor kleine molecules. In 1977, een gen dat codeert voor de 14 aminozuursequentie somatostatine sequentie was een van de eerste gemodificeerde polypeptiden gemaakt met E. coli 1. Al snel na in 1979, werd insuline gekloond in plasmide pBR322, getransformeerd, uitgedrukt, en gezuiverd 2. Sindsdien hebben recombinante eiwitten hun invloed uitgebreid naar meerdere velden van research zoals biomaterialen, drug delivery, tissue engineering, biofarmaceutische, landbouw, industriële enzymen, biobrandstoffen, etc. (zie voor referenties 3-8). Dit is grotendeels te wijten aan de veelzijdigheid die de techniek biedt via de toevoeging van toepassingsspecifieke chemische delen of eiwit sequenties voor doeleinden zoals, maar niet beperkt tot, doeleiwit identificatie, stabilisering en zuivering.
Via recombinant DNA technologie kunnen recombinante eiwitten tot expressie worden gebracht in een verscheidenheid van eukaryotische en prokaryotische gastheer met inbegrip van zoogdieren, planten, insecten, gist, schimmels of bacteriën. Elke host biedt verschillende voordelen en typisch het beste systeem wordt bepaald op basis van eiwitfunctie, opbrengst, de stabiliteit, de totale kosten en schaalbaarheid. Bacteriecellen missen vaak de post-translationele modificatie mechanismen die eukaryotische gastheren (dat wil zeggen glycosylering, disulfide bridging, e tc.) 5. Daardoor zoogdier en insecten systemen meestal resulteren in betere compatibiliteit en expressie van eukaryote eiwitten, maar deze systemen zijn doorgaans duurder en tijdrovender 9. Daarom E. coli is de favoriete gastheer voor onze expressie systeem omdat de cellen snel uit te breiden in goedkope groeicondities en de genetische expressie mechanismen zijn goed begrepen 5,9. Bovendien is dit systeem eenvoudig opschaling voor productiedoeleinden en resulteert in functionele eiwitten ondanks het ontbreken van post-translationele modificaties 10. De E. coli K12 stam wordt gekozen in dit protocol voor het klonen, omdat deze stam biedt uitstekende plasmide rendementen op basis van hoge efficiëntie van de transformatie. Bovendien, een E. coli BL21 stam wordt gebruikt voor expressie, omdat deze host stam bevat de T7 RNA polymerase gen waarbij gereguleerde eiwit expressie en stabiliteit 11 biedt.
tent "> Na hostselectie moeten verdere zorg worden genomen bij het selecteren van de ideale expressievector geselecteerde en gecontroleerde eiwitexpressie te vergemakkelijken. synthetiseren recombinante eiwitten begint met een doel DNA-sequentie die is gekloneerd onder leiding van bacteriofaag T7 transcriptie en translatie-signalen, en expressie wordt geïnduceerd in gastheercellen die chromosomale kopie van het T7 RNA polymerase gen 12. Deze vectoren verkregen uit plasmide pBR322 (voor overzicht zie referentie 13), wordt streng gecontroleerd door de T7-promotor oorspronkelijk ontwikkeld door Studier en collega's 14 en aanvullende controle door opname van de lac operator en lac-repressor (LAC1) 15,16. Voor recombinante eiwit-engineering, dit expressiesysteem biedt de mogelijkheid om een specifiek aminozuur sequentie van een gewenst eiwit aanpassen door het invoegen van verschillende doelwit DNA sequenties of fusie-eiwitten maken bestaande uit gecombineerde domeins van enkele eiwitten. Bovendien, sommige vectorreeks omvatten peptide tag modificaties aan het N-of C-uiteinde worden geplaatst. Voor onze design doeleinden, werd een histidine (His) tag aan de DNA-doelsequentie voor zuivering toegevoegd en een 15 aminozuur biotinylatable sequentie werd opgenomen voor biotinylatie 17,18. In dit protocol een plasmide dat een ampicilline resistentiegen, werd gekozen om onze biotinylatable fusieproteïne sequenties dragen. Expressie wordt gecontroleerd in deze vector via de T7-lac-promoter en is gemakkelijk geïnduceerd met isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG).Test uitdrukkingen (kleinschalig kweken) worden gebruikt om de aanwezigheid en de oplosbaarheid van het doeleiwit, die kan worden uitgedrukt in een oplosbare of onoplosbare vorm tot zuiveringsprocedures formuleren bepalen. Een oplosbare proteïne die binnen de bacterie cel zal spontaan vouwen ondergaan om de natieve structuur 19 te handhaven. Typisch de inheemsestructuur is thermodynamisch gunstig. In veel gevallen de metabolische activiteit van het systeem is niet bevorderlijk voor het doeleiwit, plaatsen belasting van het systeem leidt tot onoplosbare eiwitproductie en de vorming van insluitingslichamen uit onoplosbare proteïneaggregaten. Dus het doelwit eiwit denatureert, waardoor ze in het algemeen biologisch inactief 20. Beide testen uitdrukkingen worden opgeschaald en isolatieprocedures worden bepaald door de oplosbaarheid van het doeleiwit. Een extra renaturatie of terugvouwstap is vereist voor onoplosbare eiwitten. De resulterende recombinante eiwitten kunnen verder worden gezuiverd met behulp van grootte-uitsluitingschromatografie.
In huis biedt productie van recombinant eiwit kostenvoordelen ten opzichte van commerciële producten sinds milligram doelwit eiwit kan worden geïsoleerd per liter van de belangrijkste cultuur. De meeste van de benodigde apparatuur is verkrijgbaar in een typisch biologisch of chemisch laboratorium. Protein engineering zorgt voor creatieaangepaste fusie-eiwitten met toegevoegde functionaliteiten die niet in de handel verkrijgbaar zijn altijd. Figuur 1 toont de belangrijkste procedures die betrokken zijn bij techniek recombinante eiwitten. Met dit expressiesysteem hebben we veel biotinylatable eiwitten, zoals interferon-gamma, van bloedplaatjes afgeleide groeifactor, en bot-morfogenetisch eiwit 21-23 geregistreerd, maar zich op twee eiwitten die we ontworpen voor axon begeleiding, NGF (29 kDa ) en Sema3A (91 kDa) 10 (voor een overzicht zie referentie 24). Biotinylering is een veelgebruikte techniek voor identificatie, immobilisatie en isolatie van gemerkte eiwitten met behulp van de bekende biotine-streptavidine interactie 25-27. Biofysische probes 28,29, biosensoren 30, en quantum dots 31 zijn enkele voorbeelden van systemen die de hoge affiniteit van biotine-streptavidine conjugatie met een K d in de orde van 10 -15 M 27 gebruiken. De E. coli biotin ligase, BirA, helpt bij de covalente binding van biotine aan de lysinezijketen gevonden binnen de biotine gelabeld volgorde 18,32. Tethering biotine om materialen en biomoleculen heeft resulteerde in een continue levering van groeifactoren naar cel voor meerdere tissue engineering toepassingen 21,33-35. Daarom ingenieursbureau met deze speciaal ontworpen biotinylatable eiwitten is een krachtige tool die meerdere onderzoeksinteresses kunnen overstijgen.
Recombinant eiwit-engineering is een zeer krachtige techniek die vele disciplines overspant. Het is kosteneffectief, afstembare en een relatief eenvoudige procedure, waardoor de productie van hoge opbrengsten van op maat gemaakte eiwitten. Het is belangrijk op te merken dat het ontwerpen en expressie doeleiwitten is niet altijd eenvoudig. Basale expressie en recombinant proteïne stabiliteit afhankelijk van specifieke keuzen van vector, E. coli celstammen, peptide tag aanvullingen en teelt parameters. Onze spec…
The authors have nothing to disclose.
De auteurs willen graag de Universiteit van Akron erkennen voor de financiering die dit werk ondersteund.
1,4-dithio–DL-threitol, DTT, 99.5% | Chem-Impex International | 127 | 100 g |
2-Hydroxyethylmercaptan β-Mercaptoethanol | Chem-Impex International | 642 | 250 ml |
Acetic acid, glacial | EMD | AX0073-9 | 2.5 L |
Agar | Bioshop | AGR001.500 | 500 g |
Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A9518 | 25 g |
Antifoam 204 | Sigma-Aldrich | A6426 | 500 g |
Barstar-NGF pET-21a(+) | GenScript USA Inc. | 4 µg | |
BL21(DE3) Competent Cells | Novagen | 69450 | 1 ml; Expression Host |
Bradford reagent | Sigma-Aldrich | B6916 | 500 ml |
BugBuster | Novagen | 70922-3 | 100 ml |
Gel filtration standard | Bio-Rad | 151-1901 | 6 vials |
Glycerol | Bioshop | GLY001.1 | 1 L |
Guanidine hydrodioride amioformamidine hydrochloride | Chem-Impex International | 152 | 1 kg |
His-Pur Ni-NTA Resin | Thermo Scientific | 88222 | 100 ml |
Hydrochloric acid | EMD | HX0603-3 | 2.5 L |
Imidazole | Chem-Impex International | 418 | 250 g |
IPTG | Chem-Impex International | 194 | 100 g |
Laemmli sample buffer | Bio-Rad | 161-0737 | 30 ml |
Lauryl sulfate sodium salt, Sodium dodecyl surface | Chem-Impex International | 270 | 500 g |
LB Broth | Sigma-Aldrich | L3022 | 1 kg |
NovaBlue Competent Cells | Novagen | 69825 | 1 ml; Cloning Host |
Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | 10 pack |
Potassium Chloride | Chem-Impex International | 01247 | 1 kg |
Sema3A-pET-21a(+) | GenScript USA Inc. | 4 µg | |
SimplyBlue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | 1 L |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S5886-1KG | 1 kg |
Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S318-500 | 500 g |
Sodium phosphate diabasic | Sigma-Aldrich | S5136-500G | 500 g |
Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S5011 | 500 g |
Terrific Broth | Bioshop | TER409.5 | 5 kg |
Tetracycline hydrochloride | Chem-Impex International | 667 | 25 g |
Tris/Glycine/SDS Buffer, 10X | Bio-Rad | 1610732 | 1 L |
Trizma Base | Sigma-Aldrich | T1503 | 1 kg |
Tryptone, pancreatic | EMD | 1.07213.1000 | 1 kg |
Yeast extract, granulated | EMD | 1.03753.0500 | 500 g |
Name of Kits/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
ÄKTApurifier10 | GE Healthcare | 28-4062-64 | Includes kits and accessories |
Benchtop Orbital Shaker | Thermo Scientific | SHKE4000 | MAXQ 4000 |
BirA500 | Avidity | BirA500 | Enzyme comes with reaction buffers and biotin solution |
Dialysis Casette | Thermo Scientific | 66380 | Slide-A-Lyzer (Extra Strength) |
Dialysis Tubing | Spectrum Laboratories | 132127, 132129 | MWCO: 25,000 and 50,000 |
Flow Diversion Valve FV-923 | GE Healthcare | 11-0011-70 | |
FluoReporter Biotin Quantification Assay Kit | Invitrogen | 1094598 | |
Frac-950 Tube Racks, Rack C | GE Healthcare | 18-6083-13 | |
Fraction Collector Frac-950 | GE Healthcare | 18-6083-00 | Includes kits and accessories |
Heated/Refrigerated Circulator | VWR | 13271-102 | Model 1156D |
Heating Oven FD Series | Binder | Model FD 115 | |
HiLoad 16/60 Superdex 200 pg | GE Healthcare | 17-1069-01 | Discontinued–Replacement Product: HiLoad 16/600 Superdex 200 pg |
J-26 XPI Avanti Centrifuge | Beckman Coulter | 393126 | |
JA 25.50 Rotor | Beckman Coulter | 363055 | |
JLA 8.1 Rotor | Beckman Coulter | 969329 | Includes 1 L polyporpylene bottles |
JS 5.3 Rotor | Beckman Coulter | 368690 | |
Laminar Flow Hood | Themo Scientific | 1849 | Forma 1800 Series Clean Bench |
Microplate Reader | TECAN | infinite M200 | |
Mini-PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 165-8004 | 4-gel vertical electrophoresis system |
Mini-PROTEAN TGX Precast Gels | Bio-Rad | 456-9036 | Any kDa, 15-well comb |
Ni-NTA Column | Bio-Rad | 737-2512 | 49 ml volume ECONO-Column |
Plasmid Miniprep Kit | OMEGA bio-tek | D6943-01 | |
PowerPac HC Power Supply | Bio-Rad | 164-5052 | 250 V, 3 A, 300 W |
Round Bottom Polypropylene Copolymer Tubes | VWR | 3119-0050 | 50 ml tubes for JA 25.50 rotor |
Spin-X UF Concentrators | Corning | 431488, 431483 | 20 and 6 ml; MWCO: 10,000 Da |
Subcloning Service | GenScript USA Inc. | Protein Services | |
Ultrasonic Processor | Cole-Parmer | 18910445A | Model CV18 |
Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | Model G560 |