신경 조직의 재생을위한 가용성 및 불용성 바이오틴 단백질의 발현, 분리 및 정제
Summary
biotinylatable 융합 단백질을 개발하는 연구의 다양한 분야에서 많은 잠재적 인 응용 프로그램이 있습니다. 재조합 단백질 공학은 맞춤 설계된 단백질의 높은 수율을 제공하는 비용 효율적인 정직 절차입니다.
Abstract
재조합 단백질 공학은 대장균에게 (대장균) 식으로 거의 4 수십 년 동안 시스템, 오늘을 활용했다 E. 대장균은 여전히 가장 널리 사용되는 숙주이다. 시스템의 유연성은 (스트렙 트 아비딘 상호 작용을위한) 비오틴 태그와 같은 잔기 및 녹색 형광 단백질 또는 체리 적색 단백질과 같은보다 큰 단백질의 기능성 또한 허용한다. 또한, 번역 후 변형을 부여하는 금속 이온의 킬레이트 고유 반응성 작용기, 분광 프로브, 분자와 같은 부 자연스러운 아미노산의 통합은 단백질의 특성과 기능을 더 잘 조작을 가능하게했다. 따라서이 기술은 연구의 다양한 분야에 대한 중요한 유틸리티를 제공하는 사용자 정의 융합 단백질을 생성합니다. 보다 구체적으로, biotinylatable 단백질 서열 때문에 아비딘 및 스트렙 타비 딘과 비오틴 사이의 높은 친 화성 상호 작용의 다양한 표적 단백질에 통합 된. 이 추가 태그 단백질의 검출 및 정제를 강화뿐만 아니라 세포의 정렬과 같은 보조 응용 프로그램을위한 길을 열어 주었있다. 따라서, 비오틴 표지 분자는 바이오 산업 및 생명 의학 분야에서 증가하고 광범위한 영향을 보여줍니다. 우리의 연구의 목적을 위해 우리는 신경 성장 인자 (NGF) 및 semaphorin3A (Sema3A) 기능 영역을 포함하는 비 오티 닐화 재조합 융합 단백질을 설계했다. 우리는 이러한 비오틴 융합 단백질은 다른 활성 단백질 서열과 함께, 조직 공학 및 재생을 위해 생체 적합 물질에 닿는 할 수있는 방법을 이전에보고했다. 이 프로토콜은 T7의 락의 유도 성 벡터와 E를 활용하여, 밀리그램 규모 엔지니어링 biotinylatable 단백질의 기본 사항을 설명합니다 변환하는 스케일 업 (scale-up) 및 정화부터 대장균 발현 호스트.
Introduction
단백질은 궁극적으로 적절한 조직 형성과 조직에 이르는 많은 생물학적 기능에 대한 책임은 생체 분자의 넓은 범위를 커버. 이 분자는 인체 내에서 평형을 유지, 규제 업 및 / 또는 아래로 조절 유전자와 다른 단백질의 제어 신호 전달 경로의 수천을 시작합니다. 하나의 단백질의 중단은 치명적인 장애 또는 질병의 발병으로 이어질 수있는 신호의이 웹 전체에 영향을 미칩니다. 실험실에서 각각의 단백질을 설계하는 것은 이러한 부작용을 퇴치하기위한 하나의 솔루션을 제공하고 작은 분자 약물에 대한 대안을 제공합니다. 1977 년 14 아미노산 소마토스타틴 서열을 코딩하는 유전자가 E.을 사용하여 만든 제 설계 폴리펩티드 중 하나였다 대장균 1. 곧 1979 년, 인슐린, 플라스미드 나 pBR322에 복제 변형, 표현, 2 정제 하였다. 그 이후로, 재조합 단백질은 입술의 여러 필드에 자신의 영향력을 확대earch 등 생체 적합 물질, 약물 전달, 조직 공학, 바이오 의약품, 농업, 산업 효소, 바이오 연료 등 (리뷰를 참조에게 3-8 참조). 이 기술을 포함한 목적 주문형 화학 잔기 또는 단백질 서열의 첨가를 통해 제공하고 있지만, 표적 단백질 식별, 안정화 및 정제에 한정하지 않는 것이 범용성 크게 때문이다.
재조합 DNA 기술을 통해, 재조합 단백질은 포유 동물, 식물, 곤충, 효모, 균류 또는 박테리아 등의 진핵 및 원핵 숙주 다양한 시스템에서 발현 될 수있다. 각 호스트는 서로 다른 장점을 제공하며, 일반적으로 가장 좋은 시스템은 단백질 기능, 수율, 안정성, 전반적인 비용 및 확장 성을 기준으로 결정됩니다. 박테리아 세포는 종종 진핵 호스트 (즉, 당화, 디설파이드 브리지, E에게 제공하는 번역 후 변형 메커니즘을 결여 TC.) 5. 그러나 이러한 호스트는 일반적으로 더 많은 비용과 시간이 많이 구를 수 있으며 결과적으로, 포유 동물 및 곤충 시스템은 보통 진핵 단백질의 더 나은 호환성 및 식 초래한다. 따라서, E. 세포가 저렴 성장 조건에서 급속하게 확장하고 유전자 발현 메커니즘이 잘 5,9 이해하고 있기 때문에 대장균은 우리의 발현 시스템에 대한 선호 호스트입니다. 또한,이 시스템은 번역 후 변형 (10)의 부족에도 불구하고 생산의 목적과 기능 단백질의 결과에 대한 최대 크기를 조절하기 쉽다. E. 이 변형이 높은 변환 효율에 따라 우수한 플라스미드 수율을 제공하기 때문에 대장균 K12 균주 복제에 대해이 프로토콜에서 선택된다. 또한, E. 이 호스트의 변형을 제어 단백질 발현과 안정성 11를 제공하는 T7의 RNA 중합 효소 유전자를 포함하고 있기 때문에 대장균 BL21 균주 발현에 이용된다.
십t "> 호스트를 선택하면, 추가 치료는 재조합 단백질을 합성하는 박테리오파지 T7의 전사 및 번역 신호의 지시에 따라 복제 된 대상의 DNA 시퀀스를 시작합니다. 선택 및 조절 단백질 발현을 촉진하는 최적의 발현 벡터를 선택하는 촬영되어야합니다 식 T7의 RNA 중합 효소 유전자 12 염색체 사본을 포함하는 숙주 세포에서 유도된다. 플라스미드 벡터 인 pBR322에서 파생 된이 벡터는 (검토를 위해 참조 13 참조), 단단히 처음 Studier 및 동료 (14)에 의해 개발 된 T7 프로모터에 의해 제어 및 추가를 제공하고 있습니다 락 오퍼레이터와의 lac 리프레 서 (lac1)의 포함을 통해 제어 15,16. 재조합 단백질 공학의 경우,이 발현 계는 상이한 타겟 DNA 서열을 삽입하여 목적 단백질의 특정 아미노산 서열을 짓기 위해 또는 융합 단백질을 생성하는 기능을 구비 결합 도메인으로 구성하나의 단백질에서의. 또한, 일부 벡터 시리즈는 N 또는 C 말단에 배치되는 펩타이드 태그 수정이 (가) 있습니다. 우리의 설계 목적을 위해, 히스티딘 (그의) 태그는 정제 DNA 표적 서열에 첨가하고, 15의 아미노산 서열은 바이오 티 닐화 biotinylatable 17,18 위해 포함되었다. 이 프로토콜에서 암피실린 내성 유전자를 포함하는 플라스미드를, 우리 biotinylatable 융합 단백질 서열을 운반하도록 선택되었다. 표정은 T7의 lac 프로모터를 통해이 벡터 제어되어 쉽게 이소 프로필 β-D-1-티오 갈 락토 피 라노 시드 (IPTG)로 유도된다.시험 식 (소량 배양) 정제 과정을 공식화하거나 수용성 또는 불용성 인 형태로 표현 될 수있는 표적 단백질의 존재 및 용해도를 결정하기 위해 사용된다. 박테리아 세포 내에서 발현 수용성 단백질의 기본 구조 (19)를 유지하기 위해 자연 폴딩을 받게 될 것이다. 일반적으로 기본구조는 열역학적으로 바람직하다. 많은 경우에 숙주의 대사 활동은 불용성 단백질 생산 및 불용성 단백질 응집체 이루어지는 봉입체의 형성에 이르게 시스템에 응력을 배치, 표적 단백질에 공헌하지 않다. 따라서 표적 단백질은 일반적으로 20 생물학적 비활성들을 렌더링 변성. 두 시험 식은 업 스케일링하고, 분리 과정은 표적 단백질의 용해도에 의해 결정된다. 추가 탈 변성 또는 단계 폴딩은 불용성 단백질이 필요합니다. 얻어진 재조합 단백질을 더욱 크기 배제 크로마토 그래피를 이용하여 정제 할 수있다.
집에서 재조합 단백질 생산을 목적 단백질의 밀리그램의 주요 문화 리터당 고립 될 수 있기 때문에 상용 제품을 통해 비용 이점을 제공합니다. 필요한 장비의 대부분은 일반적인 생물 또는 화학 실험실에서 사용할 수 있습니다. 단백질 공학은 생성 가능항상 상업적으로 사용할 수없는 추가 기능과 사용자 지정 융합 단백질. 1 공학 재조합 단백질과 관련된 주요 절차를 묘사 그림. 이 식 시스템을 통해 우리는 인터페론 – 감마, 혈소판 유래 성장 인자 및 뼈 형태 형성 단백질 21 ~ 23 많은 biotinylatable 단백질을 생성했다, 그러나 우리는 우리가 축삭지도, NGF (29 kDa의를 위해 디자인이 단백질에 초점을 맞출 것이다 ) 및 Sema3A (91 kDa의) 10 (검토) 24을 참조를 참조하십시오. 바이오 티 닐화 식별, 고정 및 잘 알려진 비오틴 – 스트렙 타비 딘의 상호 작용을 이용하여 25 ~ 27라는 단백질의 분리에 대한 일반적인 기술입니다. 생물 물리학 프로브 (28, 29)은 30 바이오 센서, 양자 도트 (31)는 10 -15 M (27)의 순서에 K d의 비오틴 – 스트렙 타비 딘 활용의 높은 선호도를 활용 시스템의 몇 가지 예입니다. E. 대장균 바이오주석 리가, 피라는, 비오틴에서 발견 라이신 사이드 체인에 비오틴의 공유 결합에 에이즈 순서 18,32 태그. 재료 및 생체 분자에 테 더링 비오틴은 여러 조직 공학 응용 프로그램 21,33-35에 대한 세포에 성장 인자의 지속적인 전달을 생산하고있다. 따라서 이러한 맞춤 설계 biotinylatable 단백질을 설계하는 것은 여러 연구 분야를 초월 할 수있는 강력한 도구입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
재조합 단백질 공학은 여러 분야에 걸쳐있는 매우 강력한 기술이다. 이것은 맞춤 설계 단백질의 높은 수율의 생산을 허용하고 경제적 동조하고 비교적 간단한 절차이다. 이는 설계 및 표적 단백질을 발현하는 것은 항상 간단 아니라는 것을주의하는 것이 중요하다. 기초 표현 및 재조합 단백질의 안정성은 벡터, E.의 특정 선택에 따라 달라집니다 대장균 세포주, 펩타이드 태그 추가 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는이 작업을 지원하는 자금 애 크런 대학을 인정하고 싶습니다.
Materials
| 1,4-dithio–DL-threitol, DTT, 99.5% | Chem-Impex International | 127 | 100 g |
| 2-Hydroxyethylmercaptan β-Mercaptoethanol | Chem-Impex International | 642 | 250 ml |
| Acetic acid, glacial | EMD | AX0073-9 | 2.5 L |
| Agar | Bioshop | AGR001.500 | 500 g |
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A9518 | 25 g |
| Antifoam 204 | Sigma-Aldrich | A6426 | 500 g |
| Barstar-NGF pET-21a(+) | GenScript USA Inc. | 4 µg | |
| BL21(DE3) Competent Cells | Novagen | 69450 | 1 ml; Expression Host |
| Bradford reagent | Sigma-Aldrich | B6916 | 500 ml |
| BugBuster | Novagen | 70922-3 | 100 ml |
| Gel filtration standard | Bio-Rad | 151-1901 | 6 vials |
| Glycerol | Bioshop | GLY001.1 | 1 L |
| Guanidine hydrodioride amioformamidine hydrochloride | Chem-Impex International | 152 | 1 kg |
| His-Pur Ni-NTA Resin | Thermo Scientific | 88222 | 100 ml |
| Hydrochloric acid | EMD | HX0603-3 | 2.5 L |
| Imidazole | Chem-Impex International | 418 | 250 g |
| IPTG | Chem-Impex International | 194 | 100 g |
| Laemmli sample buffer | Bio-Rad | 161-0737 | 30 ml |
| Lauryl sulfate sodium salt, Sodium dodecyl surface | Chem-Impex International | 270 | 500 g |
| LB Broth | Sigma-Aldrich | L3022 | 1 kg |
| NovaBlue Competent Cells | Novagen | 69825 | 1 ml; Cloning Host |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | 10 pack |
| Potassium Chloride | Chem-Impex International | 01247 | 1 kg |
| Sema3A-pET-21a(+) | GenScript USA Inc. | 4 µg | |
| SimplyBlue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | 1 L |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S5886-1KG | 1 kg |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S318-500 | 500 g |
| Sodium phosphate diabasic | Sigma-Aldrich | S5136-500G | 500 g |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S5011 | 500 g |
| Terrific Broth | Bioshop | TER409.5 | 5 kg |
| Tetracycline hydrochloride | Chem-Impex International | 667 | 25 g |
| Tris/Glycine/SDS Buffer, 10X | Bio-Rad | 1610732 | 1 L |
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | T1503 | 1 kg |
| Tryptone, pancreatic | EMD | 1.07213.1000 | 1 kg |
| Yeast extract, granulated | EMD | 1.03753.0500 | 500 g |
| Name of Kits/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| ÄKTApurifier10 | GE Healthcare | 28-4062-64 | Includes kits and accessories |
| Benchtop Orbital Shaker | Thermo Scientific | SHKE4000 | MAXQ 4000 |
| BirA500 | Avidity | BirA500 | Enzyme comes with reaction buffers and biotin solution |
| Dialysis Casette | Thermo Scientific | 66380 | Slide-A-Lyzer (Extra Strength) |
| Dialysis Tubing | Spectrum Laboratories | 132127, 132129 | MWCO: 25,000 and 50,000 |
| Flow Diversion Valve FV-923 | GE Healthcare | 11-0011-70 | |
| FluoReporter Biotin Quantification Assay Kit | Invitrogen | 1094598 | |
| Frac-950 Tube Racks, Rack C | GE Healthcare | 18-6083-13 | |
| Fraction Collector Frac-950 | GE Healthcare | 18-6083-00 | Includes kits and accessories |
| Heated/Refrigerated Circulator | VWR | 13271-102 | Model 1156D |
| Heating Oven FD Series | Binder | Model FD 115 | |
| HiLoad 16/60 Superdex 200 pg | GE Healthcare | 17-1069-01 | Discontinued–Replacement Product: HiLoad 16/600 Superdex 200 pg |
| J-26 XPI Avanti Centrifuge | Beckman Coulter | 393126 | |
| JA 25.50 Rotor | Beckman Coulter | 363055 | |
| JLA 8.1 Rotor | Beckman Coulter | 969329 | Includes 1 L polyporpylene bottles |
| JS 5.3 Rotor | Beckman Coulter | 368690 | |
| Laminar Flow Hood | Themo Scientific | 1849 | Forma 1800 Series Clean Bench |
| Microplate Reader | TECAN | infinite M200 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 165-8004 | 4-gel vertical electrophoresis system |
| Mini-PROTEAN TGX Precast Gels | Bio-Rad | 456-9036 | Any kDa, 15-well comb |
| Ni-NTA Column | Bio-Rad | 737-2512 | 49 ml volume ECONO-Column |
| Plasmid Miniprep Kit | OMEGA bio-tek | D6943-01 | |
| PowerPac HC Power Supply | Bio-Rad | 164-5052 | 250 V, 3 A, 300 W |
| Round Bottom Polypropylene Copolymer Tubes | VWR | 3119-0050 | 50 ml tubes for JA 25.50 rotor |
| Spin-X UF Concentrators | Corning | 431488, 431483 | 20 and 6 ml; MWCO: 10,000 Da |
| Subcloning Service | GenScript USA Inc. | Protein Services | |
| Ultrasonic Processor | Cole-Parmer | 18910445A | Model CV18 |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | Model G560 |
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