Immagini dal vivo della mitosi in via di sviluppo embrionali di topo Cortex
Summary
Progenitrici neurali mitosi è un parametro critico della neurogenesi. Gran parte della nostra comprensione delle progenitrici neurali mitosi si basa sull'analisi del tessuto fisso. Vivo imaging in fettine cerebrali embrionali è una tecnica versatile per valutare mitosi con alta risoluzione temporale e spaziale in un ambiente controllato.
Abstract
Anche se di breve durata, mitosi è un processo multi-step complesso e dinamico fondamentale per lo sviluppo di organi compreso il cervello. Nella corteccia cerebrale di sviluppo, mitosi anormale di progenitori neurali può causare difetti di dimensioni e funzione cerebrale. Quindi, vi è una necessità critica per strumenti per comprendere i meccanismi di neurale progenitore mitosi. Sviluppo corticale nei roditori è un modello eccezionale per lo studio di questo processo. Progenitrici neurali mitosi è comunemente esaminati nelle sezioni di cervello fissi. Questo protocollo descrive in dettaglio un approccio per l'imaging dal vivo della mitosi in ex vivo fettine di cervello embrionali. Noi descrivere i passaggi critici per questa procedura, che includono: l'estrazione del cervello, l'incorporamento del cervello, vibratome sezionamento di fette di cervello, colorazione e coltura di fette, e time-lapse imaging. Abbiamo poi dimostrare e descrivere in dettaglio come eseguire un'analisi post-acquisizione della mitosi. Includiamo risultati rappresentativi from questo test utilizzando il colorante vitale Syto11, topi transgenici (istone H2B-EGFP e centrin-EGFP), e in utero elettroporazione (mCherry-α-tubulina). Discuteremo di come questa procedura può essere meglio ottimizzato e come può essere modificato per lo studio della regolazione genetica della mitosi. Vivo imaging di mitosi in fettine cerebrali è un approccio flessibile per valutare l'impatto dell'età, anatomia, e perturbazione genetica in un ambiente controllato, e per generare una grande quantità di dati ad alta risoluzione temporale e spaziale. Quindi questo protocollo integrerà gli strumenti esistenti per l'analisi dei neurali progenitrici mitosi.
Introduction
L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di descrivere come eseguire l'imaging dal vivo di progenitori neurali mitosi in fettine di cervello embrionali. Utilizzo di immagini dal vivo di fette di cervello nella cultura, questo protocollo fornisce un metodo semplice per saggiare molteplici aspetti della mitosi nei progenitori neurali in un ambiente altamente simile ad un ambiente in vivo. Esso può essere applicato a cervello di animali e / o cervelli mutanti che sono state manipolate con elettroporazione in utero) 1-5. Questa tecnica è ideale anche per testare l'effetto di agenti farmacologici su mitosi precursori neurali, semplicemente aggiungendo un agente al mezzo di coltura. In sintesi, questo articolo farà un protocollo tecnicamente impegnativo accessibile a coloro che studiano la neurogenesi.
Durante la neurogenesi, distinte popolazioni progenitrici neurali subiscono divisioni precise per generare neuroni che alla fine contribuiscono a sei strati corticali dell'adulto neocorteccia 6-8. All'inizio dello sviluppo corticale, la piscina precursore neurale si espande come neuroepiteliale (NE) le cellule si dividono simmetricamente di auto-rinnovarsi. Cellule NE poi convertono in cellule gliali radiali (RGCs). Inizialmente RGCs dividono simmetricamente per produrre due nuovi RGC, tuttavia durante la maggior parte della neurogenesi, la modalità principale RGC 'di divisione è asimmetrica. In divisione asimmetrica, 1 RGC dà luogo ad una nuova RGC e di un neurone post-mitotico, o un progenitore più specializzato (sia per un breve precursore neurale (SNP), un glia radiale esterna (ORG), o un progenitore intermedio (INP) 2,3,7,9. INP, SNP, e ORG possono generare neuroni alla sub-ventricolare, e regioni basali della corteccia, rispettivamente. Quindi, la divisione cellulare dei progenitori è un processo fondamentale per generare neuroni del neocorteccia.
Numerosi studi indicano una correlazione tra specifici tratti mitotici di RGCs e il destino delle cellule figlie. Haydar et al. Ed Takahashi et al.hanno dimostrato che la durata mitotico RGC e ciclo cellulare aumento di lunghezza come procede neurogenesi, un reperto eco nel follow-up di studi 10-13. Un certo numero di studi hanno suggerito che fuso mitotico orientamento rispetto al ventricolo influenza aspetti della neurogenesi e corticogenesi, compresi i tipi di neuroni generati e posizione della progenie nel cervello, rispettivamente 3,10,14-16. Sia orientamento del piano di clivaggio influenza direttamente il destino della cellula è controversa, ma la conclusione resta che questo mitotico impatti parametri neurogenesi. Ulteriori sottolineando l'importanza della mitosi è l'osservazione che molti geni coinvolti nei meccanismi di mitosi sono cruciali per la neurogenesi e per il corretto sviluppo del cervello 17-20.
La mitosi è un processo dinamico, ma fino ad oggi la maggior parte degli studi che descrivono neurali progenitrici mitosi utilizzare l'analisi di sezioni di tessuto fissi o immagini di progenitori neurali tramite coltura cellulare in vitro. Così, i metodi tradizionali per valutare la mitosi forniscono solo un'istantanea di questo processo e non riescono a scoprire come le cellule si comportano in un tessuto. Vivo imaging progenitrici neurali mitosi è diventato sempre più uno strumento fondamentale per comprendere la funzione dei progenitori neurali. Per esempi vedere questi riferimenti 4,8,10,21-25. Diversi protocolli in essere sono stati pubblicati per la preparazione e l'imaging di fette di cervello 26,27. Tuttavia ad oggi, un protocollo completo per l'imaging e analisi di mitosi non è stata descritta né dimostrato in video.
Questa tecnica offre diversi vantaggi significativi rispetto analisi fisso di sezioni cerebrali. Analisi Time-lapse di fette di cervello consente la generazione di un numero significativamente maggiore punti di dati che possono essere analizzati in modo flessibile. In primo luogo, i dati vengono raccolti presso i singoli punti di tempo nel corso di alcuni minuti a diverse ore. Si può analizzare punti temporali individuali (per creare un montaggio statico) opuò combinare diversi momenti in film. In secondo luogo, confocale di fette consente la generazione di dati in diverse sezioni Z in fettine cerebrali. Come risultato, le singole sezioni possono essere analizzati. In alternativa, pile di singole sezioni possono essere combinati in una proiezione massima intensità. Terzo, analisi viene fatta nel contesto di un tessuto, rivelando come cellule si dividono rispetto alle cellule e strutture vicine. Quarto, è ideale per l'analisi di mutanti che mostrano alcune prove di difetti mitotici. Insieme, questo protocollo aiuterà a chiarire passaggi critici per aiutare gli investigatori che intendono effettuare l'imaging dal vivo di progenitori neurali mitosi nei propri laboratori.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il principale vantaggio del protocollo abbiamo descritto è che fornisce una risoluzione temporale dinamica della mitosi di progenitori neurali. In genere, saggi di visualizzare mitosi nel cervello in via di sviluppo vengono eseguite utilizzando immunofluorescenza di sezioni di tessuto fissate. Ma questo approccio fornisce solo un'istantanea di mitosi a un certo punto volta.
Ci sono diversi passaggi che sono più critici per l'imaging mitosi in fettine di cervello: 1) Le fette di cer…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori riconoscono finanziamento dal NINDS / NIH, R00-NS064197 e NINDS / NIH, R01NS083897 (sia per DLS).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 100X N2 | Life technologies | 17502048 | for culture medium |
| 50X B27 without vitamin A | Life technologies | 12587010 | for culture medium |
| DMEM/F12 | Life technologies | 11320033 | for culture medium |
| Heat-inactivated horse serum | Sigma Aldrich | H1138-500ml | for culture medium |
| Heat-inactivated calf serum | Sigma Aldrich | F4135-500ML | for culture medium |
| FGF | R&D Sytems | 3139-FB-025 | for culture medium |
| EGF | for culture medium | ||
| 10X HBSS | Life technologies | 14065-056 | for the dissection of the embryos |
| Hepes Free Acid | Sigma Aldrich | H4034 | dilute to 1M (pH7.4) |
| 2.5M D-Glucose | Sigma Aldrich | G8769 | for the dissection of the embryos |
| 0.9M NaHC03 | Life technologies | 25080-094 | for the dissection of the embryos |
| low-melting agarose | Fisher | BP165-25 | for generating slices |
| Loctite 404 glue | Loctite 404 | 46551 | keep at 4˚C |
| syto11 | Life technologies | S7573 | Make 5µl aliquots |
| 3 mg/ml collagen type I | Life technologies | A1048301 | for culturing slices |
| glass bottom dish | MatTek | P35G-1.5-14-C | for culturing slices |
| petri dishes | for dissection of the embryos | ||
| digital thermometer | to measure the temperature of the agarose | ||
| spatula | to transfer brains | ||
| paintbrush | alternative to transfer brains | ||
| vibratome | Leica | VT1000s | for generating slices |
| dissecting microscope | dissecting out embryos | ||
| imaging microscope | A confocal microscope is required, it needs to be equipped with an incubation chamber |
References
- Gal, J. S., et al. Molecular and morphological heterogeneity of neural precursors in the mouse neocortical proliferative zones. J Neurosci. 26, 1045-1056 (2006).
- Stancik, E. K., Navarro-Quiroga, I., Sellke, R., Haydar, T. F. Heterogeneity in ventricular zone neural precursors contributes to neuronal fate diversity in the postnatal neocortex. Journal of Neuroscience. 30, 7028-7036 (2010).
- Konno, D., et al. Neuroepithelial progenitors undergo LGN-dependent planar divisions to maintain self-renewability during mammalian neurogenesis. Nat Cell Biol. 10, 93-101 (2008).
- LoTurco, J. J., Manent, J. -. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cereb Cortex. 19 Suppl 1, (2009).
- Shimogori, T., Ogawa, M. Gene application with in utero electroporation in mouse embryonic brain. Dev Growth Differ. 50, 499-506 (2008).
- Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. Development and evolution of the human neocortex. Cell. 146, 18-36 (2011).
- Englund, C., et al. and Tbr1 are expressed sequentially by radial glia, intermediate progenitor cells, and postmitotic neurons in developing neocortex. Journal of Neuroscience. 25, 247-251 (2005).
- Noctor, S. C., Flint, A. C., Weissman, T. A., Dammerman, R. S., Kriegstein, A. R. Neurons derived from radial glial cells establish radial units in neocortex. Nature. 409, 714-720 (2001).
- Wang, X., Tsai, J. -. W., Lamonica, B., Kriegstein, A. R. A new subtype of progenitor cell in the mouse embryonic neocortex. Nat Neurosci. 14, 555-561 (2011).
- Haydar, T. F., Ang, E., Rakic, P. Mitotic spindle rotation and mode of cell division in the developing telencephalon. Proc Natl Acad Sci USA. 100, 2890-2895 (2003).
- Takahashi, T., Nowakowski, R. S., Caviness, V. S. The cell cycle of the pseudostratified ventricular epithelium of the embryonic murine cerebral wall. J Neurosci. 15, 6046-6057 (1995).
- Pilaz, L. -. J., et al. Forced G1-phase reduction alters mode of division, neuron number, and laminar phenotype in the cerebral cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 21924-21929 (2009).
- Calegari, F., Huttner, W. B. An inhibition of cyclin-dependent kinases that lengthens, but does not arrest, neuroepithelial cell cycle induces premature neurogenesis. J Cell Sci. 116, 4947-4955 (2003).
- LaMonica, B. E., Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. Mitotic spindle orientation predicts outer radial glial cell generation in human neocortex. Nature Communications. 4, 1665 (2013).
- Postiglione, M. P., et al. Mouse Inscuteable Induces Apical-Basal Spindle Orientation to Facilitate Intermediate Progenitor Generation in the Developing Neocortex. Neuron. 72, 269-284 (2011).
- Silver, D. L., et al. The exon junction complex component Magoh controls brain size by regulating neural stem cell division. Nat Neurosci. 13, 551-558 (2010).
- Pulvers, J. N., et al. Mutations in mouse Aspm (abnormal spindle-like microcephaly associated) cause not only microcephaly but also major defects in the germline. Proc Natl Acad Sci USA. , 107-16595 (2010).
- Feng, Y., Walsh, C. A. Mitotic spindle regulation by Nde1 controls cerebral cortical size. Neuron. 44, 279-293 (2004).
- Megraw, T. L., Sharkey, J. T., Nowakowski, R. S. Cdk5rap2 exposes the centrosomal root of microcephaly syndromes. Trends Cell Biol. 21, 1-11 (2011).
- Bond, J., et al. A centrosomal mechanism involving CDK5RAP2 and CENPJ controls brain size. Nat Genet. 37, 353-355 (2005).
- Shu, T., et al. Doublecortin-like kinase controls neurogenesis by regulating mitotic spindles and M phase progression. Neuron. 49, 25-39 (2006).
- Nelson, B. R., Hodge, R. D., Bedogni, F., Hevner, R. F. Dynamic Interactions between Intermediate Neurogenic Progenitors and Radial Glia in Embryonic Mouse Neocortex: Potential Role in Dll1-Notch Signaling. Journal of Neuroscience. 33, 9122-9139 (2013).
- Hu, D. J. -. K., et al. Dynein recruitment to nuclear pores activates apical nuclear migration and mitotic entry in brain progenitor cells. Cell. 154, 1300-1313 (2013).
- Noctor, S. C., Martínez-Cerdeño, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nature Publishing Group. 7, 136-144 (2004).
- Tyler, W. A., Haydar, T. F. Multiplex Genetic Fate Mapping Reveals a Novel Route of Neocortical Neurogenesis, Which Is Altered in the Ts65Dn Mouse Model of Down Syndrome. Journal of Neuroscience. 33, 5106-5119 (2013).
- Noctor, S. C. Time-Lapse Imaging of Fluorescently Labeled Live Cells in the Embryonic Mammalian Forebrain. CSH Protoc. , (2011).
- Elias, L., Kriegstein, A. R. Organotypic slice culture of E18 rat brains. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2007).
- Shitamukai, A., Konno, D., Matsuzaki, F. Oblique radial glial divisions in the developing mouse neocortex induce self-renewing progenitors outside the germinal zone that resemble primate outer subventricular zone progenitors. Journal of Neuroscience. 31, 3683-3695 (2011).
- Hadjantonakis, A. -. K., Papaioannou, V. E. Dynamic in vivo imaging and cell tracking using a histone fluorescent protein fusion in mice. BMC Biotechnol. 4, 33 (2004).
- Higginbotham, H., Bielas, S., Tanaka, T., Gleeson, J. G. Transgenic mouse line with green-fluorescent protein-labeled Centrin 2 allows visualization of the centrosome in living cells. Transgenic Res. 13, 155-164 (2004).
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. R. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2007).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240, 237-246 (2001).
- Yang, Y. -. T., Wang, C. -. L., Van Aelst, L. DOCK7 interacts with TACC3 to regulate interkinetic nuclear migration and cortical neurogenesis. Nat Neurosci. 15, (2012).
- Siegenthaler, J. A., et al. Retinoic Acid from the meninges regulates cortical neuron generation. Cell. 139, 597-609 (2009).
- Schenk, J., Wilsch-Bräuninger, M., Calegari, F., Huttner, W. B. Myosin II is required for interkinetic nuclear migration of neural progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 16487-16492 (2009).
