Онлайн Визуализация Митоз в развивающихся мышиных эмбриональных Cortex
Summary
Neural митоза предшественников является критическим параметром нейрогенеза. Большая часть нашего понимания нейронной митоза предшественников на основе анализа основного ткани. Онлайн изображений в эмбриональных срезах мозга является универсальный метод для оценки митоза с высоким временным и пространственным разрешением в контролируемой среде.
Abstract
Хотя непродолжительны, митоз является сложной и динамичной многоступенчатый процесс основополагающее значение для развития органов, включая мозг. В развивающихся коры головного мозга, нарушение митоза нейронных клеток-предшественников может вызвать дефекты в размере мозга и функции. Таким образом, существует острая необходимость в инструментах, чтобы понять механизмы нервной митоза предшественников. Развития коры у грызунов является выдающимся моделью для изучения этого процесса. Neural митоза предшественников обычно рассматриваются в фиксированных срезов головного мозга. Этот протокол будет подробно описать подход к живого изображения митоза в бывших естественных условиях эмбриональных срезах мозга. Мы опишем важные шаги для этой процедуры, которые включают в себя: добычу мозга, мозг вложение, Vibratome секционирования срезах мозга, окрашивание и культивирование срезов и покадровой обработки изображений. Затем мы продемонстрировать и подробно описывают, как выполнять анализ после приобретения митоза. Мы включаем Представитель Результаты фром этот анализ с использованием жизненно красителя Syto11 трансгенные мыши (гистонов H2B-EGFP и ЦентрИН-EGFP) и внутриутробное электропорации (mCherry-α-тубулина). Мы обсудим, как эта процедура может быть лучше оптимизирован и как он может быть изменен для изучения генетической регуляции митоза. Живая съемка митоза в срезах мозга является гибкий подход к оценке влияния возраста, анатомии, и генетической возмущения в контролируемой среде, и генерировать большое количество данных с высоким временным и пространственным разрешением. Поэтому этот протокол будет дополнять существующие инструменты для анализа нейронной митоза предшественников.
Introduction
Общая цель этого протокола заключается в описании, как выполнять Живая съемка нервной митоза предшественников в эмбриональных срезах мозга. Использование живых изображений срезах мозга в культуре, этот протокол обеспечивает простой метод для анализа несколько аспектов митоза в нейронных клеток-предшественников в среде высоко аналогичной обстановке в естественных условиях. Он может быть применен к мозгу мутантных животных и / или мозгов, которые были изменены с внутриутробное электропорации) 1-5. Этот метод также идеально подходит для проверки эффекта фармакологических агентов на митоз нейронных предшественников, путем простого добавления агента к культуральной среде. В целом, эта статья будет сделать технически сложный протокол доступным для тех, кто учится нейрогенез.
Во время нейрогенеза, различные нервные популяции предшественников пройти точные подразделения генерировать нейроны, которые в конечном итоге способствуют шести корковых слоев взрослого неокортекс 6-8. В начале развития коры, нейронная бассейн предшественником расширяется нейроэпителиальные (NE) клетки делятся симметрично самообновлению. NE клетки затем конвертировать в радиальных глиальных клеток (РГК). Первоначально РГК разделить симметрично производить два новых РГК, однако во время навалом нейрогенеза, основным видом РГК "деления является асимметричной. В асимметричных делений, 1 РГК приводит к новому РГК и либо постмитотических нейрона, или более специализированный прародителя (либо короткий нейронная предшественника (SNP), внешней радиальной глии (ORG), или промежуточного прародителя (ИЯФ) 2,3,7,9. INPS, ОНП, и Orgs может генерировать нейроны в суб-желудочка, желудочка и базальных отделах коры, соответственно. Таким образом, деление клетки из клеток-предшественников является фундаментальным процессом генерации нейронов неокортекс.
Многочисленные исследования указывают на корреляции между конкретными митоза черт РГК и судьбе дочерних клеток. Хайдар и др.., А Такахаши и др..показали, что продолжительность митотического РГК и длина клеточного цикла увеличение как нейрогенез доходов, нахождение отражение в последующих исследованиях 10-13. Ряд исследований показали, что митотического веретена ориентации по отношению к желудочка влияет аспекты нейрогенеза и corticogenesis, в том числе типов нейронов, генерируемых и месте потомства в мозгу, соответственно 3,10,14-16. Будь декольте самолет ориентация напрямую влияет судьбы клеток является спорным, но вывод остается, что это митотический воздействие параметров нейрогенез. Далее подчеркивает важность митоза является наблюдение, что многие гены, участвующие в механике митоза имеют решающее значение для нейрогенеза и для правильного развития мозга 17-20.
Митоз представляет собой динамический процесс, но на сегодняшний день большинство исследований подробно нейронной митоза предшественников используют анализ разделов фиксированных тканей или изображений нейронных клеток-предшественников через в пробирке культуре клеток. Таким образом, способы господствующие для оценки митоза только дают представление о данном процессе и не в состоянии раскрыть, как клетки ведут себя в ткани. Живая съемка нервной митоза предшественников все чаще становится важным инструментом для понимания нейронной функции предшественников. Примеры см. эти ссылки 4,8,10,21-25. Несколько выдающихся протоколы были опубликованы для подготовки и обработки изображений срезов мозга 26,27. Однако до настоящего времени, комплексный протокол для обработки изображений и анализа митоза не было описано и не показано в видео.
Этот метод имеет ряд существенных преимуществ по сравнению с фиксированной анализа срезов головного мозга. Покадровый анализ срезах мозга позволяет поколение значительно более точек данных, которые могут быть проанализированы в гибкой форме. Во-первых, данные собираются в отдельных точках времени в течение нескольких минут или нескольких часов. Можно анализировать отдельные моменты времени (для создания статического монтаж) илиможно совмещать различные моменты времени в кино. Во-вторых, конфокальной микроскопии срезов позволяет генерировать данные на разных Z секций в срезах мозга. В результате отдельные секции могут быть проанализированы. Кроме того, стеки отдельных секций могут быть объединены в максимальной проекции интенсивности. В-третьих, анализ выполняется в контексте ткани, показывая, как клетки делятся относительно соседних ячеек и сооружений. В-четвертых, он идеально подходит для анализа мутантов, которые показывают некоторые признаки митоза дефектов. Вместе этот протокол поможет прояснить важные шаги, чтобы помочь следователям, которые желают осуществлять живую съемку нервной митоза предшественников в их собственных лабораториях.
Protocol
Representative Results
Discussion
Основным преимуществом протокола мы описали, что она обеспечивает динамический временное разрешение митоза нейронных клеток-предшественников. Как правило, анализы визуализировать митоза в развивающемся мозге выполняются с помощью иммунофлюоресценции секций фиксированных тканей. ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы признают, финансирование из NINDS / NIH, R00-NS064197 и NINDS / NIH, R01NS083897 (как в DLS).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 100X N2 | Life technologies | 17502048 | for culture medium |
| 50X B27 without vitamin A | Life technologies | 12587010 | for culture medium |
| DMEM/F12 | Life technologies | 11320033 | for culture medium |
| Heat-inactivated horse serum | Sigma Aldrich | H1138-500ml | for culture medium |
| Heat-inactivated calf serum | Sigma Aldrich | F4135-500ML | for culture medium |
| FGF | R&D Sytems | 3139-FB-025 | for culture medium |
| EGF | for culture medium | ||
| 10X HBSS | Life technologies | 14065-056 | for the dissection of the embryos |
| Hepes Free Acid | Sigma Aldrich | H4034 | dilute to 1M (pH7.4) |
| 2.5M D-Glucose | Sigma Aldrich | G8769 | for the dissection of the embryos |
| 0.9M NaHC03 | Life technologies | 25080-094 | for the dissection of the embryos |
| low-melting agarose | Fisher | BP165-25 | for generating slices |
| Loctite 404 glue | Loctite 404 | 46551 | keep at 4˚C |
| syto11 | Life technologies | S7573 | Make 5µl aliquots |
| 3 mg/ml collagen type I | Life technologies | A1048301 | for culturing slices |
| glass bottom dish | MatTek | P35G-1.5-14-C | for culturing slices |
| petri dishes | for dissection of the embryos | ||
| digital thermometer | to measure the temperature of the agarose | ||
| spatula | to transfer brains | ||
| paintbrush | alternative to transfer brains | ||
| vibratome | Leica | VT1000s | for generating slices |
| dissecting microscope | dissecting out embryos | ||
| imaging microscope | A confocal microscope is required, it needs to be equipped with an incubation chamber |
References
- Gal, J. S., et al. Molecular and morphological heterogeneity of neural precursors in the mouse neocortical proliferative zones. J Neurosci. 26, 1045-1056 (2006).
- Stancik, E. K., Navarro-Quiroga, I., Sellke, R., Haydar, T. F. Heterogeneity in ventricular zone neural precursors contributes to neuronal fate diversity in the postnatal neocortex. Journal of Neuroscience. 30, 7028-7036 (2010).
- Konno, D., et al. Neuroepithelial progenitors undergo LGN-dependent planar divisions to maintain self-renewability during mammalian neurogenesis. Nat Cell Biol. 10, 93-101 (2008).
- LoTurco, J. J., Manent, J. -. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cereb Cortex. 19 Suppl 1, (2009).
- Shimogori, T., Ogawa, M. Gene application with in utero electroporation in mouse embryonic brain. Dev Growth Differ. 50, 499-506 (2008).
- Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. Development and evolution of the human neocortex. Cell. 146, 18-36 (2011).
- Englund, C., et al. and Tbr1 are expressed sequentially by radial glia, intermediate progenitor cells, and postmitotic neurons in developing neocortex. Journal of Neuroscience. 25, 247-251 (2005).
- Noctor, S. C., Flint, A. C., Weissman, T. A., Dammerman, R. S., Kriegstein, A. R. Neurons derived from radial glial cells establish radial units in neocortex. Nature. 409, 714-720 (2001).
- Wang, X., Tsai, J. -. W., Lamonica, B., Kriegstein, A. R. A new subtype of progenitor cell in the mouse embryonic neocortex. Nat Neurosci. 14, 555-561 (2011).
- Haydar, T. F., Ang, E., Rakic, P. Mitotic spindle rotation and mode of cell division in the developing telencephalon. Proc Natl Acad Sci USA. 100, 2890-2895 (2003).
- Takahashi, T., Nowakowski, R. S., Caviness, V. S. The cell cycle of the pseudostratified ventricular epithelium of the embryonic murine cerebral wall. J Neurosci. 15, 6046-6057 (1995).
- Pilaz, L. -. J., et al. Forced G1-phase reduction alters mode of division, neuron number, and laminar phenotype in the cerebral cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 21924-21929 (2009).
- Calegari, F., Huttner, W. B. An inhibition of cyclin-dependent kinases that lengthens, but does not arrest, neuroepithelial cell cycle induces premature neurogenesis. J Cell Sci. 116, 4947-4955 (2003).
- LaMonica, B. E., Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. Mitotic spindle orientation predicts outer radial glial cell generation in human neocortex. Nature Communications. 4, 1665 (2013).
- Postiglione, M. P., et al. Mouse Inscuteable Induces Apical-Basal Spindle Orientation to Facilitate Intermediate Progenitor Generation in the Developing Neocortex. Neuron. 72, 269-284 (2011).
- Silver, D. L., et al. The exon junction complex component Magoh controls brain size by regulating neural stem cell division. Nat Neurosci. 13, 551-558 (2010).
- Pulvers, J. N., et al. Mutations in mouse Aspm (abnormal spindle-like microcephaly associated) cause not only microcephaly but also major defects in the germline. Proc Natl Acad Sci USA. , 107-16595 (2010).
- Feng, Y., Walsh, C. A. Mitotic spindle regulation by Nde1 controls cerebral cortical size. Neuron. 44, 279-293 (2004).
- Megraw, T. L., Sharkey, J. T., Nowakowski, R. S. Cdk5rap2 exposes the centrosomal root of microcephaly syndromes. Trends Cell Biol. 21, 1-11 (2011).
- Bond, J., et al. A centrosomal mechanism involving CDK5RAP2 and CENPJ controls brain size. Nat Genet. 37, 353-355 (2005).
- Shu, T., et al. Doublecortin-like kinase controls neurogenesis by regulating mitotic spindles and M phase progression. Neuron. 49, 25-39 (2006).
- Nelson, B. R., Hodge, R. D., Bedogni, F., Hevner, R. F. Dynamic Interactions between Intermediate Neurogenic Progenitors and Radial Glia in Embryonic Mouse Neocortex: Potential Role in Dll1-Notch Signaling. Journal of Neuroscience. 33, 9122-9139 (2013).
- Hu, D. J. -. K., et al. Dynein recruitment to nuclear pores activates apical nuclear migration and mitotic entry in brain progenitor cells. Cell. 154, 1300-1313 (2013).
- Noctor, S. C., Martínez-Cerdeño, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nature Publishing Group. 7, 136-144 (2004).
- Tyler, W. A., Haydar, T. F. Multiplex Genetic Fate Mapping Reveals a Novel Route of Neocortical Neurogenesis, Which Is Altered in the Ts65Dn Mouse Model of Down Syndrome. Journal of Neuroscience. 33, 5106-5119 (2013).
- Noctor, S. C. Time-Lapse Imaging of Fluorescently Labeled Live Cells in the Embryonic Mammalian Forebrain. CSH Protoc. , (2011).
- Elias, L., Kriegstein, A. R. Organotypic slice culture of E18 rat brains. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2007).
- Shitamukai, A., Konno, D., Matsuzaki, F. Oblique radial glial divisions in the developing mouse neocortex induce self-renewing progenitors outside the germinal zone that resemble primate outer subventricular zone progenitors. Journal of Neuroscience. 31, 3683-3695 (2011).
- Hadjantonakis, A. -. K., Papaioannou, V. E. Dynamic in vivo imaging and cell tracking using a histone fluorescent protein fusion in mice. BMC Biotechnol. 4, 33 (2004).
- Higginbotham, H., Bielas, S., Tanaka, T., Gleeson, J. G. Transgenic mouse line with green-fluorescent protein-labeled Centrin 2 allows visualization of the centrosome in living cells. Transgenic Res. 13, 155-164 (2004).
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. R. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2007).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240, 237-246 (2001).
- Yang, Y. -. T., Wang, C. -. L., Van Aelst, L. DOCK7 interacts with TACC3 to regulate interkinetic nuclear migration and cortical neurogenesis. Nat Neurosci. 15, (2012).
- Siegenthaler, J. A., et al. Retinoic Acid from the meninges regulates cortical neuron generation. Cell. 139, 597-609 (2009).
- Schenk, J., Wilsch-Bräuninger, M., Calegari, F., Huttner, W. B. Myosin II is required for interkinetic nuclear migration of neural progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 16487-16492 (2009).
