Dreidimensional Kulturen: Ein Werkzeug, um Architektur zu studieren Normale acinar gegen maligne Transformation von Brustzellen
Summary
Dreidimensionale Kultur von Säugetier-Epithelzellen auf einem rekonstituierten Basalmembran ist eine nützliche Methode, um die in vivo-Architektur der gutartigen Brust rekapitulieren und den malignen Phänotyp von gutartigen Brust Phänotyp zu differenzieren. Wichtiger ist, kann dieses System angewandt werden, um invasive Karzinome in anderen Geweben zu untersuchen.
Abstract
Invasive Mammakarzinome sind eine Gruppe von malignen epithelialen Tumoren gekennzeichnet durch die Invasion von benachbarten Geweben und Neigung zu metastasieren. Das Zusammenspiel von Signalen zwischen Krebszellen und ihrer Mikroumgebung übt einen starken Einfluss auf das Wachstum von Brustkrebs und biologischen Verhalten ein. Die meisten dieser Signale aus der extrazellulären Matrix verloren gehen oder ihre Relevanz under wird, wenn Zellen in einem zweidimensionalen Kultur (2D) als Monolayer gezüchtet. In den letzten Jahren hat dreidimensionale (3D) Kultur auf einer rekonstituierten Basalmembran als Methode der Wahl, um die Gewebearchitektur von benignen und malignen Brustzellen rekapitulieren entstanden. Zellen in 3D gewachsen behalten die wichtigen Signale aus der extrazellulären Matrix und einen physiologisch relevanten ex vivo-System 2,3. Zu beachten ist, gibt es immer mehr Hinweise darauf, dass Zellen verhalten sich anders, wenn im Vergleich zu 2D in 3D 4 gewachsen. 3D-Kulturkann effektiv als ein Mittel, um die malignen Phänotyp von der gutartigen Brust Phänotyp zu differenzieren und für die Untermauerung der zellulären und molekularen Signal verwendet werden 3 beteiligt. Eines der charakteristischen Merkmale von gutartigen epithelialen Zellen ist, dass sie polarisiert sind, so daß die apikale Zytoplasma zu dem Lumen und der basalen Zytoplasma ruht auf der Basalmembran. Diese apikal-basalen Polarität in der invasiven Mammakarzinome, die durch zelluläre Desorganisation und Bildung anastomosierenden und Verzweigung Tubuli, die planlos infiltriert das umgebende Stroma gekennzeichnet sind verloren. Diese histopathologischen Unterschiede zwischen gutartigen Drüse und invasives Karzinom in 3D 6,7 reproduziert werden. Mit den entsprechenden Lese-outs, wie die Quantifizierung der einzelnen Runde acinar Strukturen oder differentielle Expression von validierten molekulare Marker für Zellproliferation, Apoptose Polarität und in Kombination mit anderen molekularen und zellbiologischen Techniken, 3D-culturE kann ein wichtiges Instrument, um die zellulären Veränderungen während der malignen Transformation und für die Abgrenzung der zuständigen Melde besser zu verstehen ist.
Introduction
Dreidimensionale Kultur (3D) von Brust-Epithelzellen auf rekonstituierte Basalmembran ist ein wichtiges Modellsystem, um die komplexe Phänotyp und zugehörige Signalisierung der normalen Brust und Brustkrebs 2,3 studieren. Die funktionelle Einheit der Brust ist der Endkanal lobulären Einheit (TDLU), die von einer kleinen Leitung, die Verzweigungen in Acini besteht. Die Acini sind hochorganisierten Strukturen, zwei Zellschichten, Epithel und Myoepithelzellen, die durch eine Basalmembran 5 umgeben sind, besteht. Die prägnantesten Merkmale des normalen Azini sind zelluläre Polarisation, Anbringung an der zugrunde liegenden Basalmembran und spezialisierten Zell-Zell-Kontakten. Dieses komplizierte Organisation ist in invasiven Karzinomen gestört. Die weit verbreiteten 2D Kulturen, in denen Zellen werden als Monoschichten gezüchtet, nicht für die Bildung der Acini zu ermöglichen. Somit wird die Monoschichtkultur fehlen in der Bereitstellung eines Systems, um die komplexen Beziehungen zwischen Epithelzellen zu erfassenin normalen Brust und ihre Deregulierung bei Brustkrebs. Funktionelle monotypic epithelialen Kulturen der Brustzellen wurden in mehreren Laboratorien 2,3 entwickelt. 3D-Kultur geht das Wachstum von Brust-Zellen auf Matrigel, die eine gelösten Extrakt aus Engelbreth-Holm-Swarm-Maus-Sarkom-Zellen abgeleitet ist und im Handel erhältlich. Andere 3D-Substrate wie Kollagen I werden ebenfalls verwendet. Die Brust-Zellen in 3D mit 3D-Embedded-Test, bei dem Zellen kultiviert in Matrigel 2 eingebettet sind kultiviert werden. Alternativ können Zellen durch 3D auf Assay kultiviert werden, die auch als 3D-Overlay-Assay, die kostengünstig ist, wie es erfordert weniger Volumen von Matrigel und erleichtert Zeitraffer-Überwachung der Koloniebildung durch Phasenkontrast-Bildgebung und ist ideal für in situ-Bildgebung 2 -3. Die 3D auf Test ist verwendet worden, um die Korrelation zwischen der acinar Phänotyp und Genexpressionsprofil 7 definieren.
3D-Kultur kann effektiver werdenEly verwendet, um normale und benignen Zellen von invasiven Karzinomen zu unterscheiden. Normal-und gutartigen Brustzellen bilden Wachstum verhaftet polarisierten Strukturen mit einem gut definierten Hohlraum in der Mitte auf der Erwägung, dass Matrigel invasiven Karzinomzellen überaus produktiv und planlos wachsen ohne Lichtung des Lumens. E6/E7 verewigt menschlichen Brust Epithelzellen und MCF10A Zelllinie, die eine spontan immortalisierte Zelllinie aus einem 36-jährigen Patienten mit Mastopathie isoliert, wurden erfolgreich eingesetzt, um die gutartige Brust Phänotyp in 3D 3,8 zurückzuerobern und wurden als serviert wird, ist ein Modellsystem, um die onkogene und Tumor-Suppressor-Funktion von mehreren Molekülen 8,9 studieren. Diese gutartigen Zellen können verändert werden, um Gen (e) von Interesse durch die Einführung von Lentiviren / Retrovirus manipulieren. Wenn das Gen (e) von Interesse ist ein Tumorsuppressor, werden shRNA-vermittelten Knockdown zu einer malignen Transformation wohin führen, wenn das Gen von Interesse ist ein Onkogen-Überexpression in benignen Zellensollte einen malignen Phänotyp zeigen. In beiden Fällen sind die in 3D gebildet acinar Strukturen können die maligne Transformation zu erfassen.
Gutartige Einzelzellen in 3D vernickelt beginnen sich zu vermehren und bilden runde kugelförmige Strukturen. 5-8 Tage nach dieser sphärische Aggregat von Zellen wird in eine Umgebung polarisierte Schicht von Zellen, die in Kontakt mit dem Matrigel ist, und einer inneren Masse von weniger polarisierten Zellen, die Kontakt mit dem Matrigel fehlt unterscheiden. In den nächsten 10 bis 15 Tagen werden die inneren Zellen werden beginnen, durch Apoptose bildet eine klare Lumen sterben. Die malignen Zellen wachsen ihre Polarität planlos zu verlieren. Sehr bösartige Zellen bilden in der Regel Verzweigungsstrukturen. Diese Unterschiede im Phänotyp kann durch Zeitablauf Phasenkontrast-Bildgebung und durch in situ-Immunfärbung mit relevanten molekularen Marker erfasst werden. Die am häufigsten verwendeten Marker sind alpha 6-Integrin, eine basale Polaritätsmarkierung, in Verbindung mit dem Proliferationsmarker Phospho-Histon-3 und der apoptotic Marker Caspase-3 gespalten. Letzteres ist wichtig, um zu bestimmen, ob die Lumenbildung in der Mitte der Acini einem Merkmal der normalen und benignen Zellen. Andere Polarität und Zell-Zell-Kontakt Marker umfassen GM130, Laminin, ERM, E-Cadherin. Abwechselnd die Brustkrebszelllinien konstruiert werden, um das Gen von Interesse manipulieren. In diesem Fall wird eine Rückkehr zu mehr Wachstum verhaftet kann gutartig Phänotyp verwendet werden, wie ein ausgelesen, um von der Krebs-Phänotyp unterscheiden.
3D-Kultur kann auch verwendet werden, um sorgfältig die Signalwege in der malignen Transformation beteiligt 10-11 abzugrenzen. Mit Hilfe der oben genannten Lese-outs, pharmakologische Inhibitoren, blockierende Antikörper oder rekombinante Proteine kann auf molekularer Signal die zu malignen Transformation ermitteln werden kann. Mit anhaltenden Bemühungen von verschiedenen Labors ist es möglich, die Zellen zu extrahieren, um aus 3D-RNA isolieren und bereiten auch Lysate für Immunoblotting und Immunnoprecipitation. Diese Strategien werden in einer schrittweisen und detailliert in dem Protokoll beschrieben.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir haben hier die dreidimensionale Kultur von Brustepithelzellen auf einer rekonstituierten Basalmembran und die Nützlichkeit des Systems, zwischen bösartigen gegen gutartige Brust Phänotyp differen beschrieben. Dieses System kann auch zur Bildung verschiedener Zelltypen anderer Drüsengewebe verwendet werden, und es wurde berichtet, um erfolgreich zu Kultur Prostata-Epithelzellen, bronchiale Epithelzellen und Schilddrüsen-Epithelzellen verwendet haben, um nur einige zu nennen 12-14. Die Bedeutung der 3D…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde vom NIH Zuschüsse R01 CA107469, R01 CA125577 und U01CA154224 CG Kleer, der University of Michigan Cancer Center Support unterstützt.
Materials
| Growth Factor Reduced matrigel | BD biosciences | 354230 | Avoid repeat freeze thaw |
| Lab-Tek glass hamber slides 8-well | Thermo Fisher Scientific | 177402 | Precool on ice |
| Lab-Tek glass chamber slides 2- well | Thermo Fisher Scientific | 177380 | Precool on ice |
| goat anti mouse F(ab´)2 fragment | Jackson Immunoresearch | 115-006-006 | |
| Normal goat serum | Jackson Immunoresearch | 005-000-121 | |
| Fluorescent conjugated Alexa antibodies | Molecular probes | Please look at molecular probes website | |
| Prolong gold antifade reagent with DAPI | Molecular Probes | P36935 | |
| 3D Culture Cell Harvesting kit | Trevigen | 3448-020-k | |
| Anti-Apha-6-integrin | Fisher Scientifics | MAB1378 | 1:00 dilution for IF |
| Anti-GM130 | BD Biosciences | 610822 | 1:00 dilution for IF |
| Anti-phospho-histone 3 (Ser10)FITC Conjugated | Fisher Scientifics | 16-222 | 1:100 dilution for IF |
| Anti-Cleaved caspase 3 (Asp 175) | Cell Signaling | 9661s | 1:50 dilution for IF |
| Anti-E-cadherin | BD Biosciences | 610181 | 1:200 dilution for IF |
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