Трехмерная культура эпителиальных клеток молочной железы на восстановленного базальной мембраны является полезным методом резюмировать архитектуру в естественных условиях доброкачественной груди, и дифференцировать злокачественные фенотипа от фенотипа доброкачественной молочной железы. Важно отметить, что эта система может быть применена для изучения инвазивных карцином в других тканях.
Инвазивным раком молочной железы представляют собой группу злокачественных эпителиальных опухолей характеризуется вторжения в соседние ткани и склонность к метастазированию. Взаимодействие сигналов между раковыми клетками и их микросреды оказывает мощное влияние на рост рака молочной железы и биологическое поведение 1. Тем не менее, большинство из этих сигналов от внеклеточного матрикса, потеряны или их актуальность недостаточно изучена, когда клетки выращивают в культуре двумерной (2D) в виде монослоя. В последние годы трехмерная (3D) культура на восстановленного базальной мембраны возник как метод выбора резюмировать тканевое архитектуру доброкачественных и злокачественных клеток молочной железы. Клетки, выращенные в 3D сохранить важные сигналы от внеклеточного матрикса и обеспечить физиологически соответствующую Экс Vivo системы 2,3. Следует отметить, что появляется все больше доказательств предполагая, что клетки ведут себя по-разному при выращивании в 3D по сравнению с 2D 4. 3D культурамогут быть эффективно использованы в качестве средства различения злокачественного фенотипа с фенотипом доброкачественной молочной и лежащие в основе клеточных и молекулярных сигналов участвуют 3. Одной из отличительных характеристик доброкачественных эпителиальных клеток является то, что они поляризованы так, чтобы верхушечная цитоплазма к полости, а базальная цитоплазма лежит на базальной мембране. Это апикально-базальной полярности теряется в инвазивным раком молочной железы, которые характеризуются клеточной дезорганизации и формирования анастомоз и ветвление канальцы, что случайно проникает в окружающий стромы. Эти гистологические различия между доброкачественной железы и инвазивным раком могут быть воспроизведены в 3D 6,7. Используя соответствующие выходы для чтения как количественного один раунд ацинарных структур или дифференциальной экспрессии проверенных молекулярных маркеров для клеточной пролиферации, полярности и апоптоза в сочетании с другими молекулярных и клеточных методов биологии, 3D культурное может служить важным инструментом для лучшего понимания клеточных изменений во злокачественной трансформации и для очерчивания ответственного сигнализации.
Трехмерная культура (3D) молочной эпителиальных клеток на восстановленного базальной мембраны является важным модельной системой для изучения сложного фенотипа и связанного сигнализацию нормальной молочной железы и рака молочной железы 2,3. Функциональная единица груди является выводной проток очаговая блок (TDLU), который состоит из небольшой канал, который разветвляется на ацинусов. В ацинусы очень организованные структуры, состоящие из двух слоев клеток, эпителиальных и миоэпителиальных клеток, которые окружены базальной мембраной 5. Наиболее отличительные черты нормальных ацинусов являются клеточными поляризация, привязанность к подлежащей базальной мембраны и специализированные контакты межклеточные. Это сложная организация нарушается в инвазивным раком. Широко используемые 2D культур, где клетки выращивают в виде монослоев, не позволяют для формирования ацинусов. Таким образом, монослой культуры недостает обеспечение системы для захвата сложную взаимосвязь между эпителиальными клеткамив нормальном груди и их дерегулирования при раке молочной железы. Функциональные монотипический эпителиальные культуры клеток молочной железы были разработаны в нескольких лабораториях 2,3. 3D культура включает рост клеток молочной железы на Матригель, который является солюбилизированного экстракта получают из Engelbreth-Холм-Swarm клеток саркомы мыши и коммерчески доступен. Другие 3D субстраты, как коллаген Я также используются. Груди клетки можно культивировать в 3D на 3D встроенного анализа, где культивируют клетки встроены в Матригель 2. Кроме того, клетки можно культивировать на 3D на верхнем анализа, которая также называется 3D наложения Пробирной, который является экономически эффективным, так как требует меньшего объема Матригель, и облегчает времени мониторинг прошествии образования колоний контрастной томографии фазы и идеально подходит для на месте визуализации 2 -3. 3D сверху анализа был использован для определения корреляции между ацинозной фенотипа и профиля экспрессии генов 7.
3D культура может быть effectivелы используется, чтобы различать нормальные и доброкачественных клеток от инвазивной карциномы. Нормальные и доброкачественные клетки груди образуют рост арестован поляризованных структур с четко определенными просвет в центре на Матригель тогда инвазивные клетки карциномы растут в изобилии и бессистемно, без очистки просвета. Е6/Е7 увековечены человека эпителиальные клетки молочной железы и клеточной линии MCF10A, который является спонтанно увековечены клеточная линия, выделенный из 36-летнего пациента с фиброзно-кистозной изменений, были успешно использованы, чтобы вернуть фенотип доброкачественной молочной железы в 3D 3,8 и послужили модельная система для изучения онкогенных и супрессоров опухолей функцию нескольких молекул 8,9. Эти доброкачественные клетки могут быть спроектированы, чтобы манипулировать ген (ы) из интереса путем введения лентивирусов / ретровируса. Если ген (ы) интерес представляет собой супрессор опухоли, shRNA обусловленный нокдаун приведет к злокачественной трансформации, тогда как, если интересующий ген является избыточная экспрессия онкогена в клетки доброкачественныхдолжен показать злокачественного фенотипа. В обоих случаях ацинарные структуры, образованные в 3D может захватить злокачественной трансформации.
Доброкачественные одиночные клетки высевали в 3D начинают размножаться и образуют вокруг сферические структуры. Днем 5-8 этот сферический агрегат клеток будет дифференцироваться в окружающей поляризованного слоя клеток, который находится в контакте с Матригель и внутренней массой менее поляризованных клетках, в которых отсутствует контакт с Матригель. В ближайшие 10-15 дней внутренние клетки начинают умирать от апоптоза формирования четкого просвет. Злокачественные клетки будут расти случайно теряют свою полярность. Высоко злокачественные клетки обычно образуют ветвящиеся структуры. Эти различия в фенотипа могут быть захвачены времени контрастности изображений промежуток фазы и на месте иммуноокрашивания с соответствующими молекулярных маркеров. Наиболее часто используемые маркеры альфа 6-интегрин, базальный полярность маркер, в сочетании с распространением маркера фосфо-гистон 3 и apoptotМикросхема маркер расщепляется каспазы-3. Последнее важно, чтобы определить, есть ли просвет формирование в центре ацинусов, особенность нормальных и злокачественных клеток молочной железы. Другие полярности и межклеточного контакта маркеры включают GM130, ламинин, ERM, E-кадгерина. В качестве альтернативы линии клеток рака молочной железы может быть спроектирован для управления представляющий интерес ген. В этом случае возврат к более роста доброкачественных задержанного фенотип может быть использован как считывать отличить от фенотипа рака.
3D культура также может использовать осторожно, чтобы очертить сигнальные пути, участвующие в злокачественной трансформации 10-11. Использование указанное выше индикаторы, устройства фармакологические ингибиторы, блокирующие антитела или рекомбинантные белки могут быть использованы быть точно на молекулярном сигнализации, ведущие к злокачественной трансформации. С неустанные усилия различных лабораториях можно извлечь клетки от 3D изолировать РНК, а также подготовить лизатов для иммуноблотинга и IMMUnoprecipitation. Эти стратегии описаны в поэтапной и подробным образом в протоколе.
Мы описали здесь трехмерную культуру эпителиальных клеток молочной железы на восстановленного базальной мембраны и полезность этой системы различать фенотипа доброкачественной молочной злокачественная против. Эта система также может быть использован для культуры различных типов ?…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана NIH гранты R01 CA107469, R01 CA125577 и U01CA154224 к CG Kleer, Университета онкологический центр поддержки Мичигана.
Growth Factor Reduced matrigel | BD biosciences | 354230 | Avoid repeat freeze thaw |
Lab-Tek glass hamber slides 8-well | Thermo Fisher Scientific | 177402 | Precool on ice |
Lab-Tek glass chamber slides 2- well | Thermo Fisher Scientific | 177380 | Precool on ice |
goat anti mouse F(ab´)2 fragment | Jackson Immunoresearch | 115-006-006 | |
Normal goat serum | Jackson Immunoresearch | 005-000-121 | |
Fluorescent conjugated Alexa antibodies | Molecular probes | Please look at molecular probes website | |
Prolong gold antifade reagent with DAPI | Molecular Probes | P36935 | |
3D Culture Cell Harvesting kit | Trevigen | 3448-020-k | |
Anti-Apha-6-integrin | Fisher Scientifics | MAB1378 | 1:00 dilution for IF |
Anti-GM130 | BD Biosciences | 610822 | 1:00 dilution for IF |
Anti-phospho-histone 3 (Ser10)FITC Conjugated | Fisher Scientifics | 16-222 | 1:100 dilution for IF |
Anti-Cleaved caspase 3 (Asp 175) | Cell Signaling | 9661s | 1:50 dilution for IF |
Anti-E-cadherin | BD Biosciences | 610181 | 1:200 dilution for IF |