Summary
小管形成实验是测量在体外血管生成一种快速的，可量化的方法。内皮细胞结合的条件培养基并接种于基底膜提取物。管形成时小时内新形成的小管很容易量化。
Abstract
血管生成是用于正常组织发育和伤口愈合的重要方法，而且还与多种病理状况相关联。通过此协议，血管生成可在体外快速的，可量化的方式进行测量。初级或永生化的内皮细胞被混合的条件培养基并接种于基底膜基质。内皮细胞形成毛细血管样结构响应于在条件培养基中发现的血管生成信号。该管形成迅速发生与血管内皮细胞开始1小时内和含腔，小管开始出现在2个小时的赞同。管可以使用相衬倒置显微镜进行可视化，或者细胞可以与现有的测定法和管通过荧光或共聚焦显微镜观察钙黄绿素AM被处理。的分支站点/节点，回路的数量/网格，或数字或形成管的长度可以很容易地量化为在VITR措施Ø血管生成。总之，本试验可用于确定基因和参与了促进或抑制血管生成中具有快速，可重复的，和定量的方式通路。
Introduction
血管生成，新血管从先前存在的血管的发展，是各种过程，包括器官发育，胚胎发育和伤口愈合1-3至关重要。新开发的血管，内皮细胞，供应氧气和营养物质，内衬以组织，促进造血细胞的免疫监视和清除废物的2,4。血管生成是至关重要的胚胎和胎儿发育过程中。然而，这种方法保持休眠期间除外伤口愈合，骨生长，怀孕次数或月经周期1-3期间在成体中。
在过去的二十年中，调节血管生成的关键分子机制已经开始出现。血管新生是一个严格监管的情况下，通过亲和抗血管生成信号，包括整合，趋化因子，血管生成素，氧传感代理商，交界性分子和内源性抑制剂5平衡。一旦proangiogenic信号，如碱性成纤维细胞生长因子（bFGF），血管内皮生长因子（VEGF），血小板衍生生长因子（PDGF），和表皮生长因子（EGF），激活内皮细胞受体的内皮细胞释放的蛋白酶降解基底膜。内皮细胞，然后增殖和迁移，以每6,7天数毫米的速度形成豆芽。
血管生成与多种病理状况，包括癌症，牛皮癣，糖尿病性视网膜病，关节炎，哮喘，自身免疫性疾病，感染性疾病，动脉粥样硬化和8-10相关联。由于血管生成的各种疾病的重要性，了解调节这一过程是更好的治疗设计的关键基因和途径。
在管道形成试验是一种快速和定量的方法，用于确定参与血管生成基因或通路。于1988年首先描述，此测定法的基本原则是内皮细胞保持分裂和迅速地响应于血管生成的信号11-13迁移的能力。此外，血管内皮细胞被诱导分化和形成管样结构，当上的基底膜提取物（BME）的基质中培养。这些管道包括通过连接复合体连在一起的内皮细胞围成的管腔。管形成很快发生最管在该测定中形成内2-6小时，这取决于数量和血管生成的刺激的类型。
几种类型的内皮细胞可用于该测定中既包括原代细胞和永生化细胞系14,15。本文使用的细胞系是小鼠3B-11，但是相同的方法可以与其他内皮细胞系如SVEC4-10（小鼠）或原代内皮细胞，例如血管内皮细胞（人）的细胞被应用。这取决于细胞系用于与是否内皮策LLS转化或未转化，优化将需要被进行，以确定所需要的适当的管道形成了理想的时间。
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Protocol
1，收集条件培养基来测试潜在的血管生成
- 成长伯或永生化细胞可以用于血管生成或抗血管生成潜力的天然的或低血清培养基中进行测试，并收集条件培养基。
- 或者，使用立即条件培养基，或等分并储存在-80℃下几个月。使用nonconditioned天然或低血清培养基作为阴性对照，并使用非条件完全生长培养基（10％FBS，或适当浓度）作为阳性对照。可替代地，测试血管生成的潜在刺激剂，补充剂木炭剥离介质缺乏生长因子与已知浓度的感兴趣的特定蛋白质，并比较单独的生长因子的培养基。
2，准备内皮细胞在测定前的
- 两天来测定之前，通过3B-11细胞变成一个新的T-75瓶。细胞的传代次数是重要。该测定时效果最好的细胞是在第二和第六通道之间。该测定将无法正常工作，如果之前的第二或10次传代后的内皮细胞被使用。
- 生长细胞24小时，在补充有10％FBS，2mM的L-谷氨酰胺，1mM丙酮酸钠，100单位/ ml青霉素和100微克/毫升链霉素。
- 前一天测定，血清饥饿3B-11细胞中，如下所示：
- 吸媒体从3B-11细胞。
- DMEM中添加降低血清培养基补充有0.2％FBS，2mM的L-谷氨酰胺，1mM的丙酮酸钠，100单位/ ml青霉素和100微克/毫升链霉素。
- 生长细胞另外24小时。
3，试剂的配制在测定前
注：BME浓度变化很大取决于很多。 BME不能很好地工作，如果浓度小于10毫克/毫升，所以BME制造商应购买，以确保现有接触收购一个足够浓很多。
- 除霜低生长因子BME在冰箱中。 BME温暖，当凝固，所以它必须保持低温才能使用。 BME能在冷藏条件下可保存数周，或分装冷冻在-80℃。
- 减小的生长因子BME优于传统的生物医学工程。血管生成因子在BME缺乏会更容易地看到，因子从条件培养基对管形成的影响。
- 要测试的解冻介质。
4，准备内皮细胞前立即测定的
- 洗3B-11细胞的DPBS。
- 如果可视荧光或共聚焦显微镜是期望的，洗涤3B-11细胞之前，钙黄绿素AM增加内皮细胞中的介质，以2微克/毫升的最终浓度。放置钙黄绿素标记的细胞在黑暗中，在37℃和5％CO 2之前测定的开始。溶解钙黄绿素的股票AM在DMSO中，并一次钙黄绿素稀释在DMSO中的媒体最终浓度应不超过0.1％。后从细胞30-45分钟洗净钙黄绿素AM（步骤4.1以上），并继续与实验如下。
- 加入1ml胰蛋白酶-EDTA至T-75烧瓶中Trypsinize细胞。
- 胰蛋白酶消化完成后，中和胰蛋白酶通过再悬浮细胞至10ml的终体积在DMEM，10％FBS，2mM的L-谷氨酰胺，1mM的丙酮酸钠，100单位/ ml青霉素和100微克/毫升链霉素。
- 通过100微米的细胞过滤过滤单元以去除团块。
- 计数细胞，重悬细胞，以7.5×10 6个细胞/在DMEM毫升，10％FBS，2mM的L-谷氨酰胺，1mM丙酮酸钠，100单位/ ml青霉素的终浓度，和100微克/毫升链霉素。
5，小管形成实验
- 放置在冰箱或在冰上20-30分钟24孔板和1ml提示加载板，使得BME不PREM前aturely凝固。
- 移液管加入250μl低生长因子BME成24孔板的每个孔中。避免未踩下吸管的最后一站，而配药产生气泡。注意使足够BME保持在中心孔的弯月面的形式时;如果矩阵是太薄，则细胞将只形成单层。
- 孵育24孔板，在37℃和5％CO 2的30分钟以固化BME。
- 一旦BME已成立，混合约300微升条件培养基用10微升悬浮3B-11细胞（约75,000细胞）。
- 调整的条件培养基和细胞取决于所用的内皮细胞类型镀的数量，并测试该条件培养基中的连续稀释液以证明活性。如果在不同条件下生长的比较单元，规范化条件培养基体积对细胞进行用于调节所述介质的数量。
- 管西港岛线升开始形成在2-4小时。根据在条件培养基中的血管生成因子的浓度，峰值管形成，可能会出现小时，并在测定的时间在3和12将需要被优化。如果用原代内皮细胞，而不是永生化细胞的工作，初始管形成可以通过几个小时延迟。
- 管经常会开始恶化内18小时，内皮细胞会进行细胞凋亡。
- 在高峰管形成时，从阱小心吸出介质，以避免破坏在BME管网络。
- 每1毫升的DPBS，然后吸出好洗。
- 立即可视化，使用连接到一台数码相机，或荧光/共聚焦显微镜，如果细胞用钙黄绿素AM如4.1.1倒置显微镜加入1 ml新鲜的DPBS到每个孔中，图像中的管网。
- 要解决管网可视化后，加入4％多聚甲醛为每吸出，并培育15分钟，在室温下进行。
- 除去多聚甲醛固定，用DPBS冲洗两次，然后加入1ml新鲜的DPBS到每个孔中。
- 显微镜下的图像之前固定的几个管会在此过程中断裂。
- 每1毫升的DPBS，然后吸出好洗。
6，定量管网
- 量化的管网中的几个不同的方式根据研究者的偏好，和几个计算机程序有能力来测量以下参数：管子的数目;中环/目数;的分支站点/节点数目;长管。
- 使用有代表性的计算机程序，例如与血管生成分析器插件16，用于管网的定量的Image J。
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Representative Results
鼠标3B-11内皮细胞接种在固化低生长因子BME - 在该试验中，产品的基质胶，使用 - 和随后随着时间的推移。 如图1中 ，由任一鼠角质细胞或成纤维细胞分泌的血管生成因子能够诱导管的形成随时间的。血管内皮细胞迁移，并开始在1-2小时电镀形成小分支。最大管形成是通过使用先前从角质细胞获得的条件培养基4-6小时到达。 24小时，一些分支机构仍然存在，但许多细胞凋亡成为和管开始断开。
细胞数量对管子形成了深远的影响（ 图2）。当细胞数量不足接种在基质上，很少管形成和网络是最小的。随着越来越多的细胞是种子，所述管网络变得更加广泛。但是，在过高的浓度，细胞开始结块或形成单层和治疗组之间的差异变得蒙面。
管形成与3B-11细胞的工作原理最好与第二和第六代的细胞。第六次传代后，细胞没有形成广泛的网络;细胞不会形成10次传代后，任何重大的网络。细胞应至少有两个通道，从液氮储存恢复，以确保足够的管形成（ 图3）之后。 3B-11的增长速度是如此之快，以致细胞的25％，传有一天会产生汇合烧瓶第二天。
通过相差显微镜使用4X和20X的目标图像可以很容易地记录下来。然而，如果荧光图像被需要，钙黄绿素AM可以加入，并通过荧光或共聚焦显微镜（ 图4）的管网可视化。有几种不同的方法来检测和量化管网络的形成。最常见的实现方法具分析的DS涉及管的数量进行定量，节点，环路/网格，或管的长度。这些参数可以通过手工或算可通过各种成像方案，包括NIH ImageJ的与血管生成分析器插件来实现。每个这些类型的分析的例子示于图4。
图1鼠标3B-11内皮细胞的管腔形成的一段时间内，总共1×10 5个细胞每孔接种于低生长因子BME用350微升的条件培养基，从任一成纤维细胞或角质形成细胞。管形成被记录在24个小时的过程中。
<登记/> 图2对血管内皮细胞的管腔形成的细胞数目的影响。3B-11细胞中的浓度范围为5×10 4〜2×10 5，350微升成纤维细胞或角质形成细胞的条件培养基，然后对接种在孔中其次随着时间的推移。注意缺乏管形成在孔中镀以5×10 4个细胞和细胞在孔中的拥挤镀用2×10 5个细胞。
图3的通道数对内皮细胞管形成的影响。共 1×10 5个细胞每孔接种于低生长因子BME在通道0，1，或2，小管形成用通道2之前见过。
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图4荧光显微成像和血管形成的定量。之前测定的开始，内皮细胞可以用钙黄绿素AM，以可视化使用荧光或共聚焦显微镜对细胞进行处理。已经有用于定量所形成的管网络，包括计数管的数目已报道的一些方法中，循环/网格分支站点/节点，或管的长度。在这里，我们将展示如何与血管生成插件软件NIH图像J可以获得对钙黄绿素使用AM染色管网（ 一）检测总节点（红色）/管（粉红色）/网格（蓝色）组合（B）和合并在网络（C）。此外，该程序可以被用来单独地检测节点（D），管（E），或网状物（F），然后其可以被量化（G
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Discussion
血管生成是涉及在生理和病理过程。研究参与血管生成的机制要求使用概括在血管生成中的重要步骤测定的。内皮细胞管形成测定提供了几个优点优于其它试验。很容易设置，是比较廉价，生产小时内小管，并且是可量化的。此外，它可以在24位或96孔板内完成，因此可用于高通量筛选，以确定该刺激因子或抑制血管生成。虽然我们用3B-11小鼠内皮细胞为我们的实验中，测定可与各种人或鼠内皮系，包括内皮细胞和SVEC进行。
要执行的内皮细胞管形成测定，内皮细胞被混合与含有亲或抗血管生成因子和镀覆在低生长因子基底膜基质的条件培养基。 Endotheli人细胞开始1小时内和含流明，小管开始出现在2个小时的赞同。管形成可以使用相衬倒置显微镜进行可视化，或钙黄绿素AM可以在测定法和管子用荧光或共聚焦显微镜观察的结论进行添加。
结果可以被优化在几个方面。首先，原代细胞应该是理想的第二和第六通道之间。使用细胞先于第二或10次传代后，不利于实现最大的管道形成。第二，细胞数也必须根据所用的细胞类型和行来进行优化。对于鼠标3B-11，我们发现在24孔板培养的小鼠角化细胞和成纤维细胞条件培养基用75,000-100,000细胞/孔的最大应答。使用过少的细胞导致很少或没有管形成，过多的细胞导致形成单层或结块的。最后，调节介质的使用量应该是正常的化，以细胞数，而不是蛋白质浓度。如果使用正常的介质有10％FBS中，FBS将占大多数通过标准蛋白质测定来测量蛋白质浓度。浓度看起来几乎相同，即使数目的细胞，并因此调节过程中所分泌的蛋白的浓度，之间的治疗可能是高度可变的。
总之，该管形成试验是一种快速，可重复的和灵敏的方法在体外测定的血管生成。它具有比其它测定法的优点，是一种有用的方法，以确定基因和通路，发挥潜在的激活或抑制血管生成中起重要作用。
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Disclosures
作者什么都没有透露。
Acknowledgments
这项研究由美国国家癌症研究所在美国国立卫生研究院院内研究计划的一部分得到了支持，并通过新华保险给予UA5CA152907。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Costar 24-well tissue culture-treated plate | Corning | 3524 | |
| BD Matrigel basement membrane matrix, growth factor reduced | BD Biosciences | 354230 | |
| Gibco 0.05% trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| Gibco L-glutamine 200 mM (100x) | Life Technologies | 25030-081 | |
| Gibco pen strep | Life Technologies | 15140-122 | |
| Gibco DMEM (1x) | Life Technologies | 11965-092 | |
| Gibco DPBS (1x) | Life Technologies | 14190-144 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlas Biologicals | F-0500-A | |
| Calcein AM | Life Technologies | C3100MP | |
| DMSO | ATCC | 4-X |
References
- Carmeliet, P. Angiogenesis in life, disease and medicine. Nature. 438, 932-936 (1038).
- Carmeliet, P., Jain, R. K. Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis. Nature. 473, 298-307 (2011).
- Potente, M., Gerhardt, H., Carmeliet, P. Basic and therapeutic aspects of angiogenesis. Cell. 146, 873-887 (2011).
- Coultas, L., Chawengsaksophak, K., Rossant, J. Endothelial cells and VEGF in vascular development. Nature. 438, 937-945 (2005).
- Bouis, D., Kusumanto, Y., Meijer, C., Mulder, N. H., Hospers, G. A. A review on pro- and anti-angiogenic factors as targets of clinical intervention. Pharmacological research : the official journal of the Italian Pharmacological Society. 53, 89-103 (2006).
- Ausprunk, D. H., Folkman, J. Migration and proliferation of endothelial cells in preformed and newly formed blood vessels during tumor angiogenesis. Microvascular research. 14, 53-65 (1977).
- Chung, A. S., Lee, J., Ferrara, N. Targeting the tumour vasculature: insights from physiological angiogenesis. Nature reviews. Cancer. 10, 505-514 (2010).
- Chung, A. S., Ferrara, N.
- Kerbel, R. S.
- Folkman, J.
- Kubota, Y., Kleinman, H. K., Martin, G. R., Lawley, T. J. Role of laminin and basement membrane in the morphological differentiation of human endothelial cells into capillary-like structures. The Journal of cell biology. 107, 1589-1598 (1988).
- Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Benton, G. The endothelial cell tube formation assay on basement membrane turns 20: state of the science and the art. Angiogenesis. 12, 267-274 (2009).
- Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract. Nature protocols. 5, 628-635 (2010).
- Walter-Yohrling, J., et al. Murine endothelial cell lines as models of tumor endothelial cells. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 10, 2179-2189 (2004).
- Connell, K. A., Edidin, M. A mouse lymphoid endothelial cell line immortalized by simian virus 40 binds lymphocytes and retains functional characteristics of normal endothelial cells. Journal of immunology. , Baltimore, Md. 144-521 (1950).
- Carpentier, G.
