Summary
El ensayo de formación de tubo es un método rápido, cuantificable para medir la angiogénesis in vitro. Las células endoteliales se combinan con los medios condicionados y se sembraron en extracto de membrana basal. La formación del tubo se produce dentro de horas y los túbulos recién formadas cuantificarse fácilmente.
Abstract
La angiogénesis es un proceso vital para el desarrollo del tejido normal y la curación de heridas, pero también se asocia con una variedad de condiciones patológicas. Usando este protocolo, la angiogénesis se puede medir in vitro de una manera rápida, cuantificable. Células endoteliales primarias o inmortalizadas se mezclan con medio condicionado y se sembraron en la matriz de la membrana basal. Las células endoteliales forman estructuras similares a capilares en respuesta a señales angiogénicas que se encuentran en los medios condicionados. La formación del tubo se produce rápidamente con células endoteliales comenzando a alinearse dentro de 1 hora y túbulos que contienen lumen-comenzando a aparecer dentro de 2 horas. Los tubos pueden ser visualizados utilizando un microscopio invertido de contraste de fase, o las células pueden ser tratadas con calceína AM antes del ensayo y tubos visualizado a través de fluorescencia o microscopía confocal. El número de sitios de sucursal / nodos, bucles / mallas, o el número o la longitud de los tubos formados pueden ser fácilmente cuantificado como una medida de en vitro angiogénesis. En resumen, este ensayo se puede usar para identificar los genes y las vías que están involucrados en la promoción o inhibición de la angiogénesis en una manera rápida, reproducible y cuantitativo.
Introduction
La angiogénesis, el desarrollo de nuevos vasos sanguíneos a partir de vasos preexistentes, es vital para una variedad de procesos que incluyen el crecimiento de órganos, el desarrollo embrionario, la cicatrización de heridas y 1-3. Nuevo desarrollo de los vasos sanguíneos, se alinearon por las células endoteliales, el suministro de oxígeno y nutrientes a los tejidos, la promoción de la vigilancia inmunológica de las células hematopoyéticas y eliminar los productos de desecho 2,4. La angiogénesis es de vital importancia durante el desarrollo embrionario y fetal. Sin embargo, este proceso permanece latente en el adulto, excepto en tiempos de cicatrización de heridas, el crecimiento del esqueleto, el embarazo o durante el ciclo menstrual 1-3.
En las últimas dos décadas, los mecanismos moleculares que regulan la angiogénesis clave han comenzado a surgir. La angiogénesis es un evento estrictamente regulados, equilibrada por señales pro y antiangiogénicos, que incluyen las integrinas, quimiocinas, angiopoyetinas, agentes de detección de oxígeno, moléculas de unión y los inhibidores endógenos 5. Una vez proangiogenic señales tales como el factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) y factor de crecimiento epidérmico (EGF) activan los receptores de las células endoteliales de las células endoteliales liberan proteasas para degradar la membrana basal. Las células endoteliales proliferan y migran a continuación, la formación de brotes a una velocidad de varios milímetros por día 6,7.
La angiogénesis está asociada con diversas condiciones patológicas, incluyendo cáncer, psoriasis, retinopatía diabética, artritis, asma, trastornos autoinmunes, enfermedades infecciosas, y la aterosclerosis 8-10. Debido a la importancia de la angiogénesis en diversas enfermedades, la comprensión de los genes y las vías que regulan este proceso es fundamental para el diseño de mejores terapias.
El ensayo de formación de tubo es un método rápido y cuantitativo para la determinación de genes o rutas implicadas en la angiogénesis. Descrita por primera vez en 1988,los principios subyacentes de este ensayo son que las células endoteliales conservan la capacidad de dividirse y migrar rápidamente en respuesta a las señales angiogénicas 11-13. Además, las células endoteliales son inducidas a diferenciarse y formar estructuras similares a tubos cuando se cultivan sobre una matriz de extracto de membrana basal (BME). Estos tubos contienen un lumen rodeado por las células endoteliales unidas entre sí a través de complejos de unión. La formación del tubo se produce rápidamente con la mayoría de los tubos que forman en este ensayo a las 2-6 horas dependiendo de la cantidad y tipo de estímulos angiogénicos.
Varios tipos de células endoteliales pueden ser utilizados para este ensayo incluyendo tanto células primarias y líneas celulares inmortalizadas 14,15. La línea celular utilizada para este artículo fue ratón 3B-11, pero la misma metodología se puede aplicar con otras líneas de células endoteliales tales como SVEC4-10 (ratón) o células endoteliales primarias tales como las células HUVEC (humanos). Dependiendo de la línea celular se utiliza y si el ce endotelialLLS se transforman o no transformadas, tendrá que ser llevado a cabo para identificar el momento ideal necesaria para la formación correcta del tubo de optimización.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Colección de medio condicionado a la Prueba de Potencial angiogénico
- Se cultivan las células primarias o inmortalizadas a ensayar para poder angiogénico y anti-angiogénico en medio de suero nativas o bajas y recoger el medio condicionado.
- Alternativamente, el uso de medios acondicionados de inmediato, o se dividió en alícuotas y se almacenó a -80 ° C durante varios meses. Utilizar los medios de suero nativa o bajo nonconditioned como un control negativo, y el uso de medios no acondicionado completa de crecimiento (10% de FBS, o la concentración apropiada) como control positivo. Alternativamente, para probar posibles estimuladores de la angiogénesis, suplemento de carbón despojado medios que carecen de factores de crecimiento con concentraciones conocidas de proteínas específicas de interés y se compara con el factor de crecimiento medios de comunicación libres por sí solos.
2 Preparación de las células endoteliales antes del ensayo
- Dos días antes del ensayo, el paso 3B-11 células en un nuevo matraz T-75. Número de paso de las células es importante. Este ensayo funciona mejor cuando las células están entre el segundo y sexto pasajes. El ensayo no va a funcionar bien si las células endoteliales se utilizan antes de la segunda o después del décimo paso.
- Se cultivan las células durante 24 horas en DMEM suplementado con 10% de FBS, 2 mM L-glutamina, piruvato de sodio 1 mM, 100 U / ml de penicilina, y 100 mg / ml de estreptomicina.
- Un día antes del ensayo, el suero de hambre células 3B-11 como sigue:
- Aspirar los medios de comunicación de las células 3B-11.
- Añadir un medio de suero reducido de DMEM suplementado con 0,2% de FBS, 2 mM L-glutamina, piruvato de sodio 1 mM, 100 U / ml de penicilina, y 100 mg / ml de estreptomicina.
- Se cultivan las células durante 24 h más.
3. Preparación de los reactivos antes del ensayo
NOTA: Las concentraciones de BME son muy variables dependientes en el lote. BME no funciona bien si la concentración es menor que 10 mg / ml, por lo tanto, el fabricante BME debe ser contactado antes de la compra para garantizaradquisición de un lote de concentrado adecuadamente.
- Descongelar reduce el factor de crecimiento BME en el refrigerador. BME se solidifica cuando se calienta, por lo que debe mantenerse en frío antes de su uso. BME se puede almacenar en el refrigerador por un par de semanas, o en alícuotas y se congeló a -80 ° C.
- Un factor de crecimiento reducido BME se prefiere sobre el tradicional BME. La falta de factores angiogénicos en el BME, será más fácil observar el efecto que los factores a partir de los medios condicionados tienen en la formación del tubo.
- Descongele los medios de comunicación a ensayar.
4 Preparación de las células endoteliales Inmediatamente antes del ensayo
- Lavado 3B-11 células en DPBS.
- Si se desea la visualización con fluorescencia o microscopía confocal, antes de lavar las células 3B-11, añadir calceína AM a las células endoteliales en los medios a una concentración final de 2 mg / ml. Coloque células marcadas calceína en la oscuridad a 37 ° C y 5% de CO 2 antes del inicio del ensayo. Disolver de stock calceınaAM en DMSO y una vez calceína se diluye en concentración final de DMSO medios de comunicación no debe exceder de 0,1%. Después de 30 a 45 min de lavado calceína AM de las células (paso 4.1) y continuar con el experimento siguiente.
- Tripsinizar las células mediante la adición de 1 ml de tripsina-EDTA al matraz T-75.
- Después de tripsinización es completa, neutralizar la tripsina resuspendiendo las células a un volumen final de 10 ml en DMEM, 10% FBS, 2 mM L-glutamina, piruvato de sodio 1 mM, 100 U / ml de penicilina, y 100 mg / ml de estreptomicina.
- Las células de filtro a través de filtro de células 100 micras para eliminar grumos.
- Contar las células y volver a suspender las células a una concentración final de 7,5 x 10 6 células / ml en DMEM, 10% FBS, 2 mM L-glutamina, piruvato de sodio 1 mM, 100 U / ml de penicilina, y 100 mg / ml de estreptomicina.
Ensayo de Formación 5. Tubo
- Coloque la placa de 24 pocillos y 1 ml de recomendaciones en el refrigerador o en hielo durante 20-30 minutos antes de cargar la placa para que el BME no Prematurely solidificar.
- Pipetear 250 l de factor de crecimiento reducido BME en cada pocillo de una placa de 24 pocillos. Evitar la creación de burbujas por no presionar la pipeta hasta la última parada, mientras que la dispensación. Tenga cuidado de que suficiente BME se mantiene en el centro del pozo cuando se forma el menisco; si la matriz es demasiado delgada, las células sólo se forman una monocapa.
- Incubar la placa de 24 pocillos a 37 ° C y 5% de CO 2 durante 30 minutos para solidificar BME.
- Una vez que BME ha puesto, mezcle aproximadamente 300 l de medio condicionado con 10 l de resuspendidas 3B-11 células (aproximadamente 75.000 células).
- Ajustar el volumen de medio acondicionado y número de células sembradas en función del tipo de célula endotelial utilizado, y probar las diluciones seriadas de los medios acondicionados para demostrar la actividad. Si las células que comparan cultivadas bajo diferentes condiciones, normalizar acondicionado volumen de medios de comunicación para el número de células que fueron utilizadas para acondicionar los medios de comunicación.
- Tubos will comienzan a formarse dentro de 2-4 horas. Dependiendo de la concentración de factor angiogénico en los medios acondicionados, la formación de pico tubo puede ocurrir entre 3 y 12 horas y el momento del ensayo tendrá que ser optimizado. Si se trabaja con células endoteliales primarias en lugar de células inmortalizadas, la formación inicial del tubo se puede retrasar por varias horas.
- Tubos a menudo comienzan a deteriorarse dentro de 18 hr y células endoteliales se someterá a la apoptosis.
- En el momento de la formación del tubo de pico, medios de comunicación cuidadosamente aspirado desde el pozo para evitar la interrupción de la red en el tubo de BME.
- Lavar cada pocillo con 1 ml de DPBS, y aspirar.
- Para la visualización inmediata, añadir 1 ml de DPBS frescas a cada tubo de la red bien y la imagen usando un microscopio invertido conectado a una cámara digital, o fluorescencia / microscopio confocal si las células se tiñeron con calceína AM como en 4.1.1.
- Para arreglar la red de metro para la visualización posterior, y añadir 4% de paraformaldehído a cadaaspirado pocillo e incubar durante 15 min a temperatura ambiente.
- Eliminar paraformaldehído, lavar dos veces con DPBS, a continuación, añadir 1 ml de DPBS frescos a cada pocillo.
- Microscópicamente imagen antes de la fijación como unos tubos pueden romper durante este procedimiento.
- Lavar cada pocillo con 1 ml de DPBS, y aspirar.
6. Cuantificación de tubo Red
- Cuantificar la red de metro de diferentes maneras dependiendo de las preferencias del investigador, y varios programas de ordenador tienen capacidad para medir los siguientes parámetros: número de tubos; número de bucles / mallas; número de sitios de sucursal / nodos; longitud de los tubos.
- Utilice programa informático representativo como imagen J con el plugin Angiogénesis analizador 16 para la cuantificación de las redes de metro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ratón 3B-11 células endoteliales fueron sembradas en el factor de crecimiento reducido solidificado BME - en este ensayo, el producto Matrigel se utilizó - y siguió a lo largo del tiempo. Como se muestra en la Figura 1, los factores angiogénicos secretados por cualquiera de los queratinocitos o fibroblastos de ratón son capaces de inducir la formación de tubos con el tiempo. Las células endoteliales migran y se empiezan a formar las ramas pequeñas dentro de 1-2 horas de la siembra. Formación de tubo máxima se alcanzó por 4-6 hr utilizando medios acondicionados previamente obtenidos a partir de queratinocitos. Por 24 horas, algunas ramas se mantuvieron, pero muchas de las células apoptóticas y se convirtieron en los tubos comenzaron a desconectar.
El número de células tiene un profundo impacto en la formación del tubo (Figura 2). Cuando un número suficiente de células se siembran en la matriz, unos tubos forman y la red es mínimo. A medida que más se siembran las células, la red de metro se hace más extensa. Sin embargo, demasiado alto de una concentración, las células comienzan a aglutinarse o formarmonocapas, y las diferencias entre los grupos de tratamiento se convierten en máscaras.
La formación de tubos con células 3B-11 funciona mejor con las células entre el segundo y sexto pasajes. Después de que el sexto paso, las células no se forman como una red extensa; células no formarán cualquier red importante después del décimo paso. Las células deben tener un mínimo de dos pasajes después de la reactivación del almacenamiento en nitrógeno líquido para asegurar la formación de tubo adecuada (Figura 3). La tasa de crecimiento de 3B-11 es tan rápido que el 25% de las células a pases algún día producir un confluente frasco al día siguiente.
Las imágenes pueden ser fácilmente documentados a través de un microscopio de contraste de fase utilizando objetivos entre 4X y 20X. Sin embargo, si se desean imágenes fluorescentes, se puede añadir calceína AM y la red de metro visualizada a través de la fluorescencia o microscopía confocal (Figura 4). Hay varias maneras diferentes para detectar y cuantificar la formación de la red de tubos. El más común methods de análisis implican cuantificación del número de tubos, nodos, bucles / mallas, o la longitud de los tubos. Estos parámetros se pueden contar con la mano o se pueden hacer a través de diversos programas de imágenes, incluyendo NIH ImageJ con el plugin Angiogénesis analizador. Ejemplos de cada uno de estos tipos de análisis se muestran en la Figura 4.
Figura 1. ratón 3B-11 la formación de tubos de células endoteliales en el tiempo. Un total de 1 x 10 5 células fueron sembradas por pocillo en el factor de crecimiento reducido BME con 350 l de medio acondicionado de fibroblastos o queratinocitos, ya sea. La formación del tubo se registró en el transcurso de 24 horas.
< br /> Figura 2. El efecto del número de células en la formación del tubo celular endotelial. 3B-11 células fueron sembradas en pocillos a concentraciones comprendidas entre 5 × 10 4 2 x 10 5 con 350 l de fibroblastos o queratinocitos medios acondicionado, y luego seguido en el tiempo. Tenga en cuenta la falta de formación de tubos en los pocillos en placas con 5 x 10 4 células y la aglomeración de células en los pocillos en placas con 2 x 10 5 células.
Figura 3. El efecto del número de paso en la formación del tubo celular endotelial. Un total de 1 x 10 5 células fueron sembradas por pocillo en el factor de crecimiento reducido BME en el pase 0, 1, 2 o formación Poco tubo fue visto antes del paso 2.
4 "fo: contenido-width =" "src =" 5in / files / ftp_upload / 51312 / 51312fig4highres.jpg "width =" 500 "/>
Figura 4. de imágenes de microscopía de fluorescencia y la cuantificación de la formación del tubo. Antes del comienzo del ensayo, las células endoteliales pueden ser tratados con calceína AM con el fin de visualizar las células por medio de fluorescencia o microscopía confocal. Ha habido varios métodos reportados para la cuantificación de la red de tubo formado, incluyendo contando el número de tubos, Bucles / mallas, sitios de ramificación / nodos, o la longitud de los tubos. Aquí, mostramos cómo NIH Image J con el software del plugin La angiogénesis se puede utilizar en un calceína AM red de metro de colores (A) para detectar nodos totales (rojo) / tubos (rosa) / malla (azul) en combinación (B) y fusionamos en red (C). Además, este programa puede ser utilizado para detectar individualmente nodos (D), tubos (E), o malla (F) que luego puede ser cuantificada (G
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
La angiogénesis está implicada en los procesos fisiológicos y patológicos. El estudio de los mecanismos implicados en la angiogénesis requiere el uso de ensayos que recapitular los pasos principales en la angiogénesis. El ensayo de formación de tubo celular endotelial ofrece varias ventajas sobre otros ensayos. Es fácil de configurar, es relativamente barato, produce túbulos en cuestión de horas, y es cuantificable. Además, se puede completar en 24 ó 96 placas de pocillos, y por lo tanto se puede utilizar para selección de alto rendimiento para identificar los factores que estimulan o inhiben la angiogénesis. Aunque hemos utilizado 3B-11 células endoteliales de ratón para nuestros experimentos, el ensayo se puede realizar con una variedad de líneas endoteliales humanas o murinas, incluyendo HUVEC y SVEC.
Para realizar un ensayo de formación de tubos de células endoteliales, las células endoteliales se mezclan con medio acondicionado que contiene factores pro y antiangiogénicos o chapado sobre matriz de membrana basal factor de crecimiento reducida. Endothelicélulas de Al comienzan a alinearse dentro de 1 hora y túbulos que contienen lumen-comienzan a aparecer dentro de 2 horas. La formación del tubo puede ser visualizado usando un microscopio invertido de contraste de fases, o calceína AM se puede añadir a la conclusión del ensayo y los tubos se visualizó usando fluorescencia o microscopía confocal.
Los resultados pueden ser optimizados de varias maneras. En primer lugar, las células primarias deben estar idealmente entre el segundo y sexto pasajes. El uso de células antes de la segunda o después del décimo pasaje no se sea propicio para la formación máxima del tubo. En segundo lugar, el número de células debe ser optimizado en función del tipo celular y de línea utilizado. Para ratón 3B-11, encontramos la respuesta máxima usando 75,000-100,000 células / pocillo en una placa de 24 pocillos crecido con queratinocitos de ratón y de los medios de fibroblastos acondicionado. El uso de demasiado pocas células resulta en células da como resultado una mínima o ninguna formación de tubos, y también muchos en la formación de una monocapa o aglutinación. Finalmente, la cantidad de medio acondicionado utilizado debe ser normalzado al número de células en lugar de la concentración de proteína. Si el uso de los medios de comunicación normal con 10% de FBS, las FBS darán cuenta de la mayoría de la concentración de proteína se mide a través de un ensayo de la proteína estándar. La concentración se verá casi idéntica a pesar de que el número de las células, y por lo tanto las concentraciones de las proteínas secretadas durante el acondicionamiento, entre los tratamientos pueden ser muy variables.
En resumen, el ensayo de formación de tubo es un método rápido, reproducible y sensible para la medición in vitro de la angiogénesis. Tiene ventajas sobre otros ensayos y es un método útil para determinar los genes y las vías que potencialmente desempeñan un papel importante en la activación o inhibición de la angiogénesis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Esta investigación fue financiada en parte por el Programa de Investigación Intramural del Instituto Nacional del Cáncer de los Institutos Nacionales de Salud, y por el NCI concede UA5CA152907.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Costar 24-well tissue culture-treated plate | Corning | 3524 | |
| BD Matrigel basement membrane matrix, growth factor reduced | BD Biosciences | 354230 | |
| Gibco 0.05% trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| Gibco L-glutamine 200 mM (100x) | Life Technologies | 25030-081 | |
| Gibco pen strep | Life Technologies | 15140-122 | |
| Gibco DMEM (1x) | Life Technologies | 11965-092 | |
| Gibco DPBS (1x) | Life Technologies | 14190-144 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlas Biologicals | F-0500-A | |
| Calcein AM | Life Technologies | C3100MP | |
| DMSO | ATCC | 4-X |
References
- Carmeliet, P. Angiogenesis in life, disease and medicine. Nature. 438, 932-936 (1038).
- Carmeliet, P., Jain, R. K. Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis. Nature. 473, 298-307 (2011).
- Potente, M., Gerhardt, H., Carmeliet, P. Basic and therapeutic aspects of angiogenesis. Cell. 146, 873-887 (2011).
- Coultas, L., Chawengsaksophak, K., Rossant, J. Endothelial cells and VEGF in vascular development. Nature. 438, 937-945 (2005).
- Bouis, D., Kusumanto, Y., Meijer, C., Mulder, N. H., Hospers, G. A. A review on pro- and anti-angiogenic factors as targets of clinical intervention. Pharmacological research : the official journal of the Italian Pharmacological Society. 53, 89-103 (2006).
- Ausprunk, D. H., Folkman, J. Migration and proliferation of endothelial cells in preformed and newly formed blood vessels during tumor angiogenesis. Microvascular research. 14, 53-65 (1977).
- Chung, A. S., Lee, J., Ferrara, N. Targeting the tumour vasculature: insights from physiological angiogenesis. Nature reviews. Cancer. 10, 505-514 (2010).
- Chung, A. S., Ferrara, N.
- Kerbel, R. S.
- Folkman, J.
- Kubota, Y., Kleinman, H. K., Martin, G. R., Lawley, T. J. Role of laminin and basement membrane in the morphological differentiation of human endothelial cells into capillary-like structures. The Journal of cell biology. 107, 1589-1598 (1988).
- Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Benton, G. The endothelial cell tube formation assay on basement membrane turns 20: state of the science and the art. Angiogenesis. 12, 267-274 (2009).
- Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract. Nature protocols. 5, 628-635 (2010).
- Walter-Yohrling, J., et al. Murine endothelial cell lines as models of tumor endothelial cells. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 10, 2179-2189 (2004).
- Connell, K. A., Edidin, M. A mouse lymphoid endothelial cell line immortalized by simian virus 40 binds lymphocytes and retains functional characteristics of normal endothelial cells. Journal of immunology. , Baltimore, Md. 144-521 (1950).
- Carpentier, G.
