Summary
Röret bildningsanalys är en snabb, kvantifierbar metod för att mäta in vitro angiogenes. Endotelceller kombineras med konditionerat medium och ströks ut på basalmembranextraktet. Tube bildningen sker inom timmar och nybildade tubuli lätt kvantifieras.
Abstract
Angiogenes är en viktig process för normal vävnadsutveckling och sårläkning men är också associerad med en mängd olika patologiska tillstånd. Med hjälp av detta protokoll, får angiogenes mätas in vitro på ett snabbt, mätbart sätt. Primära eller odödliggjorda endotelceller blandas med konditionerade medier och pläterade på basalmembranmatris. De endotelceller bildar kapillär liknande strukturer som svar på angiogena signaler som finns i konditionerade medier. Röret bildningen sker snabbt med endotelceller börjar anpassa sig inom 1 timme och lumen innehållande tubuli börjar dyka inom 2 tim. Rör kan visualiseras med användning av ett faskontrast inverterat mikroskop, eller cellerna kan behandlas med kalcein AM före analysen och rören visualiseras genom fluorescens eller konfokalmikroskopi. Antalet filialplatser / noder, slingor / maskor, eller antal eller längd rör bildas lätt kan kvantifieras som ett mått på i VITRo angiogenes. Sammanfattningsvis kan denna analys användas för att identifiera gener och signalvägar som är involverade i att främja eller hämning av angiogenes i en snabb, reproducerbar, och kvantitativt sätt.
Introduction
Angiogenes, utvecklingen av nya blodkärl från redan existerande kärl, är avgörande för en mängd olika processer inklusive organtillväxt, embryonal utveckling och sårläkning 1-3. Nyutvecklad blodkärl, kantade av endotelceller, utbud syre och näringsämnen till vävnader, främja immunövervakning av hematopoetiska celler och tar bort slaggprodukter 2,4. Angiogenes är av central betydelse under embryots och fostrets utveckling. Men denna process förblir vilande i den vuxna utom under tider av sårläkning, skelettillväxt, graviditet eller under menstruationscykeln 1-3.
Under de senaste två decennierna har viktiga molekylära mekanismer som reglerar angiogenes börjat växa fram. Angiogenes är en hårt reglerad händelse, viktad pro och antiangiogena signaler inklusive integriner, kemokiner, angiopoietins, syrekännande medel, Junktional molekyler och endogena inhibitorer 5. När proangiogenic signaler såsom basisk fibroblasttillväxtfaktor (bFGF), vaskulär endotelial tillväxtfaktor (VEGF), blodplättshärledd tillväxtfaktor (PDGF) och epidermal tillväxtfaktor (EGF) aktivera endotelceller receptorer endotelcellerna frisätta proteaser för att bryta ned basalmembranet. Endotelcellerna proliferera sedan och migrerar och bildar groddar med en hastighet av flera millimeter per dag 6,7.
Angiogenes är associerad med olika patologiska tillstånd, inklusive cancer, psoriasis, diabetisk retinopati, artrit, astma, autoimmuna sjukdomar, infektionssjukdomar och ateroskleros 8-10. På grund av betydelsen av angiogenes i olika sjukdomar, förstå de gener och signalvägar som reglerar denna process är kritisk för utformning av bättre terapeutiska medel.
Röret bildningsanalys är en snabb och kvantitativ metod för bestämning av gener eller reaktionsvägar som är involverade i angiogenes. Först beskrivs i 1988,principerna denna analys är att endotelceller bibehåller förmågan att dela sig och migrera snabbt svar på angiogena signaler 11-13. Vidare är endotelceller induceras för att differentiera och bilda rörliknande strukturer när odlade på en matris av basalmembranextrakt (BME). Dessa rör innehåller en lumen omgiven av endotelceller kopplas samman genom junctionala komplex. Tube bildningen sker snabbt med de flesta rör bildar i denna analys inom 2-6 h beroende på mängd och typ av angiogena stimuli.
Flera typer av endotelceller kan användas för denna analys, inklusive både primära celler och immortaliserade cellinjer 14,15. Den cellinje som används för den här artikeln var mus 3B-11, men samma metod kan tillämpas med andra endotelceller cellinjer såsom SVEC4-10 (mus) eller primära endotelceller såsom HUVEC (mänskliga) celler. Beroende på vilken cellinje används och huruvida endothelial cells omvandlas eller icke-transformerade, kommer optimerings måste genomföras för att identifiera den perfekta tiden behövs för korrekt rörbildning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 Insamling av rade media till testet för angiogena Potential
- Väx primära eller odödliggjorda celler som skall testas för angiogen eller anti-angiogen potential i inhemska eller låga serummedier och samla det konditionerade mediet.
- Alternativt använda konditionerade media omedelbart, eller i alikvoter och lagrades vid -80 ° C under flera månader. Använd nonconditioned nativt eller låg serum media som en negativ kontroll, och använda icke konditionerade komplett tillväxtmedium (10% FBS, eller lämplig koncentration) som en positiv kontroll. Alternativt att testa potentiella stimulatorer av angiogenes, komplettera träkol avskalade media saknar tillväxtfaktorer med kända koncentrationer av specifika proteiner av intresse och jämför med enbart tillväxtfaktor fria medier.
2. Framställning av endotelceller före analys
- Två dagar före analys, passage 3B-11 celler till en ny T-75-kolv. Passage antal celler är viktig. Denna analys fungerar bäst när celler är mellan de andra och sjätte passagerna. Analysen kommer inte att fungera bra om endotelceller används före den andra eller efter den tionde passagen.
- Odla cellerna under 24 h i DMEM kompletterat med 10% FBS, 2 mM L-glutamin, 1 mM natriumpyruvat, 100 U / ml penicillin och 100 | ig / ml streptomycin.
- En dag före analysen, serum svälta 3B-11-celler enligt följande:
- Aspirera media från 3B-11 celler.
- Lägg reducerat serummedier av DMEM kompletterat med 0,2% FBS, 2 mM L-glutamin, 1 mM natriumpyruvat, 100 U / ml penicillin och 100 | ig / ml streptomycin.
- Odla cellerna under ytterligare 24 tim.
3 Beredning av reagens Före analys
OBS: BME koncentrationerna är mycket varierande beroende av parti. BME fungerar inte bra om koncentrationen är lägre än 10 mg / ml, därför BME tillverkaren skall kontaktas före köp för att säkerställaförvärv av en tillräckligt koncentrerad mycket.
- Upptining reducerade tillväxtfaktor BME i kylskåp. BME stelnar när varm, så det måste hållas kallt före användning. BME kan förvaras i kylskåp under några veckor, eller alikvoter och frystes vid -80 ° C.
- En minskad tillväxtfaktor BME är att föredra framför traditionella BME. Bristen på angiogena faktorer i BME kommer att göra det lättare att observera effekten att faktorer från rade media har på tuben bildning.
- Tina media som ska testas.
4 Beredning av endotelceller Omedelbart före analys
- Tvätta 3B-11 celler i DPBS.
- Om visualisering med fluorescens eller konfokalmikroskopi önskas, innan tvätt 3B-11-celler, lägga kalcein AM till endotelcellerna i media med en slutkoncentration av 2 mikrogram / ml. Placera kalcein märkta celler i mörker vid 37 ° C och 5% CO2 före starten av analysen. Lös lager kalceinAM i DMSO och en gång kalcein späds i medium Slutkoncentrationen av DMSO får inte överstiga 0,1%. Efter 30-45 min tvätt kalcein AM från cellerna (steg 4.1 ovan) och fortsätta med försöket följer.
- Trypsinisera celler genom att tillsätta 1 ml trypsin-EDTA till T-75-kolv.
- Efter trypsinering är fullständig, neutralisera trypsin genom återsuspendering celler till en slutlig volym av 10 ml i DMEM, 10% FBS, 2 mM L-glutamin, 1 mM natriumpyruvat, 100 U / ml penicillin och 100 | ig / ml streptomycin.
- Filter celler genom 100 ìm cell sil för att ta bort klumpar.
- Räkna celler och återsuspendera cellerna till en slutlig koncentration av 7,5 x 10 6 celler / ml i DMEM, 10% FBS, 2 mM L-glutamin, 1 mM natriumpyruvat, 100 U / ml penicillin och 100 | ig / ml streptomycin.
5. Tube Formation analys
- Placera 24-brunnar och 1 ml tips i kylskåp eller på is under 20-30 min innan du fyller på plattan så att BME inte Prematurely stelna.
- Pipettera 250 ul av reducerad tillväxtfaktor BME i varje brunn i en 24-brunnars platta. Undvik att skapa bubblor genom att inte trycka ned pipetten till sitt sista stopp när dispensering. Se till att tillräckligt BME förblir i centrum av brunnen när menisken former; om matrisen är alltför tunn, kommer cellerna endast bilda ett monoskikt.
- Inkubera 24-brunnar vid 37 ° C och 5% CO2 under 30 minuter för att stelna BME.
- När BME har satt, blanda ca 300 l av rade media med 10 pl resuspenderade 3B-11-celler (ca 75.000 celler).
- Justera volymen av konditionerade mediet och antalet celler utstrukna beroende på endotelcell-typ används, och testa de seriella utspädningar av det konditionerade mediet för att visa aktivitet. Om man jämför celler odlas under olika förhållanden, normalisera rade medievolymen till antalet celler som används för att påverka medierna.
- Rör wilJag börjar bildas inom 2-4 timmar. Beroende på angiogen faktor koncentrationen i rade media, får topp rörbildning uppstå mellan 3 och 12 timmar och tidpunkten för analysen måste optimeras. Om du arbetar med primära endotelceller i stället för odödliggjorda celler, kan initial rörbildning fördröjas med flera timmar.
- Rör ofta börja att försämras inom 18 timmar och endotelceller kommer att genomgå apoptos.
- Vid tidpunkten för toppröret bildning, att noga aspirera media från brunnen undvika störningar röret nätet på BME.
- Tvätta varje brunn med 1 ml DPBS, sedan aspirera.
- För omedelbar visualisering, tillsätt 1 ml färsk DPBS till varje brunn och bildröret nätverk med ett inverterat mikroskop ansluten till en digitalkamera, eller fluorescens / konfokalmikroskop om cellerna färgades med kalcein AM som i 4.1.1.
- För att fixa röret nätverket för senare visualisering, och tillsätt 4% paraformaldehyd till varjeaspire väl och inkubera i 15 minuter vid rumstemperatur.
- Ta bort paraformaldehyd, tvätta två gånger med DPBS, tillsätt sedan 1 ml färsk DPBS till varje brunn.
- Mikroskopiskt bild före fixering så få rören kan gå sönder under denna procedur.
- Tvätta varje brunn med 1 ml DPBS, sedan aspirera.
6. Kvantifiering av Tube Network
- Kvantifiera röret nätet på flera olika sätt beroende på utredarens önskemål, och flera datorprogram har kapacitet att mäta följande parametrar: antal rör; antal slingor / maskor; antal filialplatser / noder; längden av rören.
- Använd representativa datorprogram, t.ex. Bild J med Angiogenes Analyzer plugin 16 för kvantifiering av rörsnätverk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mus 3B-11 endotelceller såddes på stelnat reducerad tillväxtfaktor BME - i denna analys, produkten Matrigel används - och följde med tiden. Såsom visas i figur 1, angiogena faktorer utsöndrade av antingen mus-keratinocyter eller fibroblaster kan inducera rörbildning över tiden. Endotelceller migrera och börjar bildas små grenar inom 1-2 timmar på plåtar. Maximal rörbildning nåddes av 4-6 tim med hjälp av konditionerade medier som tidigare erhållits från keratinocyter. Av 24 h, förblev vissa grenar, men många av cellerna blev apoptotiska och rören började koppla.
Cell nummer har en djupgående inverkan på tuben bildning (figur 2). När tillräckligt många celler ympas på matrisen, några rör bildas och nätet är minimal. När fler celler är seedade, blir röret nätverket mer omfattande. Men vid en alltför hög koncentration, cellerna börjar att klumpa eller bildamonolager, och skillnader mellan behandlingsgrupperna blir maskerad.
Rör bildning med 3B-11-celler fungerar bäst med celler mellan andra och sjätte passager. Efter den sjätte passagen, gör cellerna inte bildar lika omfattande nätverk; celler bildar inte någon större nätverk efter den tionde passagen. Celler bör ha minst två passager efter återuppliva från förvaring av flytande kväve för att säkerställa adekvat rörbildning (Figur 3). Tillväxttakten i 3B-11 är så snabb att 25% av cellerna passe en dag kommer att ge en sammanflytande kolv följande dag.
Bilder kan lätt dokumenteras genom faskontrastmikroskopi använder mål mellan 4X och 20X. Men om fluorescerande bilder önskas, kalcein AM sättas och röret nätverket visualiseras genom fluorescens eller konfokalmikroskopi (Figur 4). Det finns flera olika sätt att detektera och kvantifiera röret nätverksbildning. Den vanligaste metods för analys involverar kvantifiering av antal rör, noder, slingor / nät, eller längden på rören. Dessa parametrar kan räknas för hand eller kan ske genom olika avbildningsprogram, inklusive NIH ImageJ med Angiogenes Analyzer plugin. Exempel på var och en av dessa typer av analys visas i Figur 4.
Figur 1 Mouse 3B-11 endotelceller rörbildning över tiden. Totalt 1 x 10 5 celler såddes per brunn på minskad tillväxtfaktor BME med 350 l av konditionerade media från antingen fibroblaster eller keratinocyter. Rör bildningen registrerades under loppet av 24 timmar.
< br /> Figur 2 Effekten av cellnummer på endotelceller rörbildning. 3B-11-celler såddes i brunnar i koncentrationer från 5 x 04-02 OKTOBER x 10 5 med 350 l av fibroblaster eller keratinocyter rade medier, och sedan följt med tiden. Notera avsaknaden av rörbildning i brunnarna pläterade med 5 x 10 4 celler och ansamling av cellerna i brunnarna pläterad med 2 x 10 5 celler.
Figur 3 Effekten av passagenummer på endotelcell rörbildning. Totalt 1 x 10 5 celler såddes per brunn på minskad tillväxtfaktor BME vid passage 0, 1 eller 2 Little rörbildning sågs före passagen 2.
4 "fo: content-width =" 5in "src =" / filer / ftp_upload / 51312 / 51312fig4highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 4. Fluorescensmikroskopi avbildning och kvantifiering av rörbildning. Före starten av analysen kan endotelcellerna behandlas med calcein AM för att visualisera celler med användning av fluorescens eller konfokalmikroskopi. Det har funnits flera rapporterade metoder för kvantifiering av bildade röret nätverket, inklusive räkna antalet tuber, slingor / maskor, filialplatser / noder, eller längden på rören. Här visar vi hur NIH Image J med Angiogenesis plugin programvara kan användas på ett kalcein AM färgade röret nätverk (A) för att upptäcka den totala noder (röd) / rör (rosa) / nät (blå) i kombination (B) och slås samman på nätet (C). Dessutom kan detta program användas för att individuellt identifiera noder (D), rör (E), eller nät (F), som sedan kan kvantifieras (G
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Angiogenes är involverad i både fysiologiska och patologiska processer. Att studera mekanismer som är inblandade i angiogenes kräver användning av analyser som rekapitulera de viktigaste stegen i angiogenes. Den endotelcell röret bildningsanalys erbjuder flera fördelar jämfört med andra analyser. Det är lätt att ställa upp, är relativt billig, producerar tubuli inom några timmar, och är kvantifierbara. Vidare kan det fyllas i 24- eller 96-brunnars plattor, och kan således användas för high throughput screening för att identifiera faktorer som stimulerar eller hämmar angiogenes. Även om vi använde 3B-11 mus endotelceller för våra experiment, kan analysen utföras med ett flertal humana eller murina endotelceller linjer, inklusive HUVEC och SVEC.
För att utföra en endotelcell rörbildning assay endotelceller blandas med konditionerat medium som innehåller pro eller antiangiogena faktorer och ströks över nedsatt tillväxtfaktor basalmembranmatrisen. Endothelial cellerna börjar anpassa sig inom 1 timme och lumen innehållande tubuli börjar visas inom 2 tim. Tube bildning kan visualiseras med hjälp av en fas kontrast inverterat mikroskop, eller kalcein AM kan läggas i slutet av analysen och rör visualiseras med fluorescens eller konfokalmikroskopi.
Resultaten kan optimeras på olika sätt. Först bör primära celler vara idealiskt mellan de andra och sjätte passagerna. Använda celler före den andra eller efter det tionde passagen är inte främjar för maximal rörbildning. För det andra måste optimeras utifrån celltyp och linjen används cellnummer. För musen 3B-11, fann vi maximal respons med hjälp 75,000-100,000 celler / brunn i en 24-brunnar vuxit med mus keratinocyter och fibroblaster rade medier. Använda för få celler resulterar i minimala eller inga röret bildning, och för många celler resulterar i bildandet av ett enkelskikt eller klumpar. Slutligen bör den mängd rade medier som används vara normalserad till cellnummer istället för proteinkoncentration. Om du använder vanliga medier med 10% FBS kommer FBS svarar för huvuddelen av proteinkoncentrationen mäts genom en standardproteinanalys. Koncentrationen kommer att se nästan identiska även om antalet celler, och därför är de koncentrationer av de proteiner som utsöndras under konditioneringen, mellan behandlingar kan vara mycket varierande.
Sammanfattningsvis är röret bildningsanalysen en snabb, reproducerbar och känslig metod för in vitro-mätning av angiogenes. Den har fördelar framför andra analyser och är en användbar metod för att bestämma gener och banor som potentiellt spela en viktig roll i aktivering eller inhibering av angiogenes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Denna forskning stöds delvis av Interna Research Program för National Cancer Institute vid National Institutes of Health, och NCI bevilja UA5CA152907.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Costar 24-well tissue culture-treated plate | Corning | 3524 | |
| BD Matrigel basement membrane matrix, growth factor reduced | BD Biosciences | 354230 | |
| Gibco 0.05% trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| Gibco L-glutamine 200 mM (100x) | Life Technologies | 25030-081 | |
| Gibco pen strep | Life Technologies | 15140-122 | |
| Gibco DMEM (1x) | Life Technologies | 11965-092 | |
| Gibco DPBS (1x) | Life Technologies | 14190-144 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlas Biologicals | F-0500-A | |
| Calcein AM | Life Technologies | C3100MP | |
| DMSO | ATCC | 4-X |
References
- Carmeliet, P. Angiogenesis in life, disease and medicine. Nature. 438, 932-936 (1038).
- Carmeliet, P., Jain, R. K. Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis. Nature. 473, 298-307 (2011).
- Potente, M., Gerhardt, H., Carmeliet, P. Basic and therapeutic aspects of angiogenesis. Cell. 146, 873-887 (2011).
- Coultas, L., Chawengsaksophak, K., Rossant, J. Endothelial cells and VEGF in vascular development. Nature. 438, 937-945 (2005).
- Bouis, D., Kusumanto, Y., Meijer, C., Mulder, N. H., Hospers, G. A. A review on pro- and anti-angiogenic factors as targets of clinical intervention. Pharmacological research : the official journal of the Italian Pharmacological Society. 53, 89-103 (2006).
- Ausprunk, D. H., Folkman, J. Migration and proliferation of endothelial cells in preformed and newly formed blood vessels during tumor angiogenesis. Microvascular research. 14, 53-65 (1977).
- Chung, A. S., Lee, J., Ferrara, N. Targeting the tumour vasculature: insights from physiological angiogenesis. Nature reviews. Cancer. 10, 505-514 (2010).
- Chung, A. S., Ferrara, N.
- Kerbel, R. S.
- Folkman, J.
- Kubota, Y., Kleinman, H. K., Martin, G. R., Lawley, T. J. Role of laminin and basement membrane in the morphological differentiation of human endothelial cells into capillary-like structures. The Journal of cell biology. 107, 1589-1598 (1988).
- Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Benton, G. The endothelial cell tube formation assay on basement membrane turns 20: state of the science and the art. Angiogenesis. 12, 267-274 (2009).
- Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract. Nature protocols. 5, 628-635 (2010).
- Walter-Yohrling, J., et al. Murine endothelial cell lines as models of tumor endothelial cells. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 10, 2179-2189 (2004).
- Connell, K. A., Edidin, M. A mouse lymphoid endothelial cell line immortalized by simian virus 40 binds lymphocytes and retains functional characteristics of normal endothelial cells. Journal of immunology. , Baltimore, Md. 144-521 (1950).
- Carpentier, G.
