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Biology

Endothelzellen Schlauchbildung Assay für die Published: September 1, 2014 doi: 10.3791/51312
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 2
1Department of Biology, American University, 2Laboratory of Cancer Biology and Genetics, National Cancer Institute, NIH

Summary

Das Rohr-Assay ist eine schnelle, quantifizierbare Verfahren zum Messen in vitro Angiogenese. Endothelzellen werden mit konditioniertem Medium kombiniert und Basalmembran-Extrakt ausgestrichen. Schlauchbildung erfolgt innerhalb von Stunden und neu gebildeten Tubuli leicht quantifizieren.

Abstract

Angiogenese ist ein wichtiger Prozess für normale Gewebeentwicklung und der Wundheilung, aber auch mit einer Vielzahl von pathologischen Zuständen verbunden sind. Über dieses Protokoll kann die Angiogenese in vitro in einem schnellen, messbaren Weise gemessen werden. Primäre oder immortalisierte Endothelzellen mit konditioniertem Medium vermischt und auf Basalmembranmatrix plattiert. Die Endothelzellen bilden Kapillare artigen Strukturen in Abhängigkeit von angiogenen Signale in konditioniertem Medium gefunden. Das Rohr Bildung erfolgt schnell mit Endothelzellen beginnen, sich innerhalb von 1 Stunde und Lumen-haltigen Tubuli beginnen, innerhalb von 2 h erscheinen auszurichten. Rohre können mit einem Phasenkontrastmikroskop sichtbar invertiert werden, oder die Zellen können mit Calcein AM vor dem Assay und Rohre, durch Fluoreszenz oder konfokale Mikroskopie sichtbar behandelt werden. Die Anzahl der Verzweigungsstellen / Knoten, Schlaufen / Maschen, oder die Anzahl oder Länge der Rohre gebildet wird, leicht als ein Maß der in vitr quantifiziert werdeno Angiogenese. Zusammenfassend kann dieser Assay verwendet werden, um Gene und Signalwege, die für die Förderung oder Hemmung von Angiogenese in einem schnelle, reproduzierbare und quantitative Weise beteiligt sind, zu identifizieren.

Introduction

Angiogenese, die Bildung neuer Blutgefäße aus bereits existierenden Schiffen, ist von entscheidender Bedeutung für eine Vielzahl von Verfahren, einschließlich Organwachstum, Embryonalentwicklung, Wundheilung und 1-3. Neu entwickelten Blutgefäße, durch Endothelzellen, Versorgung mit Sauerstoff und Nährstoffen zu den Geweben ausgekleidet, die Förderung der Immunüberwachung von hämatopoetischen Zellen und entfernen Abfallprodukte 2,4. Angiogenese ist von zentraler Bedeutung während der embryonalen und fetalen Entwicklung. Allerdings ist dieses Verfahren ruhend im erwachsenen außer während Zeiten der Wundheilung, Knochenwachstums, Schwangerschaft oder während des Menstruationszyklus 1-3.

In den letzten zwei Jahrzehnten, Schlüssel molekularen Mechanismen, die Angiogenese zu regulieren haben begonnen, zu entstehen. Die Angiogenese ist ein streng regulierter Veranstaltung, die von pro und anti-angiogenen Signale einschließlich Integrine, Chemokine, Angiopoietine, Sauerstofferfassungsmittel, Junction-Moleküle und endogenen Inhibitoren 5 ausgeglichen. Sobald proangiogenic Signale, wie basischer Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF), den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF), Blutplättchen-Wachstumsfaktor (PDGF) und epidermalen Wachstumsfaktor (EGF)-Rezeptoren aktivieren die Endothelzellen Endothelzellen frei Proteasen an der Basalmembran abzubauen. Die Endothelzellen proliferieren und wandern dann bilden Sprossen mit einer Geschwindigkeit von einigen Millimetern pro Tag 6,7.

Angiogenese ist mit verschiedenen Krankheitszuständen, einschließlich Krebs, Psoriasis, diabetische Retinopathie, Arthritis, Asthma, Autoimmunerkrankungen, Infektionskrankheiten und Atherosklerose 8-10 zugeordnet. Wegen der Bedeutung der Angiogenese bei verschiedenen Krankheiten, Analyse von Genen und Signalwege, die zu regulieren Dieses Verfahren ist für die Entwicklung besserer Therapeutika.

Das Rohr-Assay ist eine schnelle und quantitative Verfahren zur Bestimmung von Genen oder Wege in der Angiogenese beteiligt. 1988 erstmals beschrieben,die Grundsätze dieses Tests zugrunde liegen, dass Endothelzellen die Fähigkeit sich zu teilen und zu migrieren rasch in Reaktion auf angiogenen Signale 11-13 behalten. Ferner sind Endothelzellen induziert, um zu differenzieren, und bilden röhrenförmige Strukturen, wenn sie auf einer Matrix von Basalmembran-Extrakt (BME) kultiviert. Diese Röhrchen enthalten ein Lumen von Endothelzellen zusammen durch junktionale Komplexe verknüpft umgeben. Schlauchbildung erfolgt schnell mit den meisten Röhren bilden in diesem Test innerhalb von 2-6 Stunden, je nach Menge und Art der angiogenen Stimuli.

Mehrere Arten von Endothelzellen kann für diesen Assay sowohl primäre Zellen und immortalisierten Zelllinien 14,15 verwendet werden. Die Zelllinie für diesen Artikel war Maus 3B-11, aber die gleiche Methodik kann mit anderen Endothel-Zelllinien, wie SVEC4-10 (Maus) oder primären Endothelzellen wie HUVEC (menschliche) Zellen angewandt werden. Je nachdem, welcher Zelllinie verwendet wird, und ob der endothelialen cells umgewandelt oder nicht transformierten, wird Optimierung müssen durchgeführt, um den idealen Zeitpunkt für die richtige Schlauchbildung erforderlich zu identifizieren.

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Protocol

1. Erhebung von konditionierten Medien für Angiogenic Mögliche Testen

  1. Wachsen primäre oder immortalisierte Zellen für angiogene oder anti-angiogene Potential in nativer oder niedrigen Serum-Medien getestet und sammeln die konditionierten Medien.
    1. Alternativ Verwendung konditionierten Medien unmittelbar oder aliquotiert und bei -80 ° C für mehrere Monate gelagert. Verwenden nonconditioned native oder niedrige Serum Medien als Negativkontrolle, und verwenden Sie nicht-konditionierten komplette Wachstumsmedien (10% FBS oder entsprechende Konzentration) als positive Kontrolle. Alternativ, um mögliche Stimulatoren der Angiogenese zu testen, zu ergänzen, Aktivkohle gereinigt Medium ohne Wachstumsfaktoren mit bekannten Konzentrationen bestimmter Proteine ​​von Interesse und zu vergleichen, um Wachstumsfaktor freien Medien allein.

2. Herstellung von Endothelzellen vor dem Test

  1. Zwei Tage vor dem Test, Durchgang 3B-11-Zellen in einen neuen T-75-Kolben. Passage Anzahl von Zellen ist wichtig,. Dieser Test funktioniert am besten, wenn die Zellen zwischen den zweiten und sechsten Passagen. Der Test wird nicht funktionieren gut, wenn Endothelzellen vor der zweiten oder nach dem zehnten Durchgang verwendet.
  2. Wachsen Zellen für 24 h in DMEM, ergänzt mit 10% FBS, 2 mM L-Glutamin, 1 mM Natriumpyruvat, 100 U / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin.
  3. Ein Tag vor dem Test, Serum verhungern 3B-11-Zellen wie folgt:
    1. Absaugen Medien aus den 3B-11-Zellen.
    2. Reduziert Serummedien DMEM, ergänzt mit 0,2% FBS, 2 mM L-Glutamin, 1 mM Natriumpyruvat, 100 U / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin.
    3. Wachsen Zellen für weitere 24 Stunden.

3. Vorbereitung der Reagenzien vor dem Test

HINWEIS: BME-Konzentrationen sehr variabel abhängig von Menge sind. BME funktioniert nicht gut, wenn die Konzentration von weniger als 10 mg / ml, daher sollte der BME-Hersteller vor dem Kauf, um sicherzustellen, kontaktiert werdenErwerb einer ausreichend konzentriert Grundstück.

  1. Abtauen reduziert Wachstumsfaktor BME in den Kühlschrank stellen. BME erstarrt, wenn warm, so muss es vor der Verwendung kalt gehalten werden. BME kann unter Kühlung für einige Wochen gelagert werden oder aliquotiert und bei -80 ° C eingefroren.
  2. Eine reduzierte Wachstumsfaktor BME über traditionelle BME bevorzugt. Das Fehlen von angiogenen Faktoren im BME wird es einfacher, den Effekt, der aus dem konditionierten Medium auf der Schlauchbildung haben Faktoren zu beobachten.
  3. Tau-Medien getestet werden.

4. Herstellung von Endothelzellen Unmittelbar vor dem Assay

  1. Wasch 3B-11-Zellen in DPBS.
    1. Wenn Visualisierung mit Fluoreszenz oder konfokalen Mikroskopie gewünscht, vor dem Waschen 3B-11-Zellen, fügen Calcein AM an die Endothelzellen in Medium mit einer Endkonzentration von 2 ug / ml. Platzieren Calcein markierter Zellen in der Dunkelheit bei 37 ° C und 5% CO 2 vor Beginn des Assays. Auflösen Lager CalceinUhr in DMSO und einmal Calcein in Medien Endkonzentration von DMSO sollte 0,1% nicht überschreiten. Nach 30-45 min Wasch Calcein AM aus den Zellen (Schritt 4.1 oben) und weiter mit dem Experiment folgt.
  2. Trypsinize Zellen durch Zugabe von 1 ml Trypsin-EDTA-T-75-Kolben.
  3. Nach vollständiger Trypsinierung ist, neutralisieren Trypsin durch Resuspendieren Zellen auf ein Endvolumen von 10 ml in DMEM, 10% FBS, 2 mM L-Glutamin, 1 mM Natriumpyruvat, 100 U / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin.
  4. Filterzellen durch 100 um Zellsieb um Klumpen zu entfernen.
  5. Zählen von Zellen und Resuspension Zellen zu einer Endkonzentration von 7,5 x 10 6 Zellen / ml in DMEM, 10% FBS, 2 mM L-Glutamin, 1 mM Natriumpyruvat, 100 U / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin.

5. Schlauchbildung Assay

  1. Platz 24-Well-Platte und 1 ml-Tipps im Kühlschrank oder auf Eis für 20-30 min vor dem Laden der Platte, so dass die BME nicht prematurely verfestigen.
  2. Pipette 250 ul reduziert Wachstumsfaktor BME in jede Vertiefung einer 24-Well-Platte. Vermeiden Sie Blasen durch Drücken der Pipette nicht bis zur Endhaltestelle unter Verzicht. Darauf achten, dass genügend BME bleibt in der Mitte des Brunnens, wenn der Meniskus Formen; wenn die Matrix zu dünn ist, werden die Zellen, die nur eine Monoschicht bilden.
  3. Inkubiere 24-Well-Platte bei 37 ° C und 5% CO 2 für 30 min auf BME verfestigen.
  4. Sobald BME eingestellt hat, mischen Sie ca. 300 ul konditionierten Medien mit 10 ul resuspendiert 3B-11-Zellen (ca. 75.000 Zellen).
    1. Stellen Sie die Lautstärke der konditionierten Medien und die Anzahl der Zellen überzogen, je nach endothelialen Zelltyp verwendet wird, und testen Sie die serielle Verdünnungen der konditionierten Medien, um die Aktivität zu demonstrieren. Vergleicht man Zellen unter verschiedenen Bedingungen gezüchtet, normalisieren konditionierten Medien Volumen auf die Zahl der Zellen, die verwendet wurden, um das Medium zu konditionieren.
  5. Rohre will beginnen, innerhalb von 2-4 Stunden zu bilden. Je nach Konzentration angiogenen Faktor in den konditionierten Medien können Spitzenröhrenbildung auftreten, zwischen 3 und 12 Stunden und der Zeitpunkt des Assays optimiert werden müssen. Bei der Arbeit mit primären Endothelzellen statt immortalisierten Zellen kann die anfängliche Schlauchbildung um mehrere Stunden verzögert werden.
    1. Röhren beginnen oft innerhalb von 18 Stunden und Endothelzellen verschlechtern wird Apoptose.
  6. Zum Zeitpunkt der Spitzenröhrenbildung zu vermeiden sorgfältig absaugen Medien aus dem Bohrloch Unterbrechung des Rohrnetzes auf der BME.
    1. Waschen Sie jede Vertiefung mit 1 ml DPBS, dann absaugen.
      1. Für die sofortige Visualisierung, 1 ml frischem DPBS in jede Vertiefung und Bild der Röhre Netzwerk mit einem inversen Mikroskop, um eine Digitalkamera, oder Fluoreszenz / konfokalen Mikroskop angebracht, wenn die Zellen mit Calcein AM wie in 4.1.1 gefärbt.
      2. Zur Fixierung des Rohrnetzes für später Visualisierung, und fügen Sie 4% Para jedemgut abgesaugt und die Proben für 15 min bei Raumtemperatur.
        1. Para entfernen, waschen zweimal mit DPBS, dann frisch DPBS hinzufügen 1 ml in jede Vertiefung.
        2. Mikroskopisch Bild vor der Fixierung so wenige Rohre können bei diesem Verfahren zu brechen.

6. Quantifizierung von Rohrnetz

  1. Quantifizierung der Rohrnetz auf verschiedene Weise, je nach Präferenz des Untersuchers und mehrere Computerprogramme die Fähigkeit haben, die folgenden Parameter zu messen: Anzahl der Rohre; Anzahl der Schleifen / Maschen; Anzahl der Verzweigungsstellen / Knoten; Länge der Rohre.
  2. Verwenden repräsentativen Computerprogramm wie Bild J mit der Angiogenese Analyzer Plugin 16 zur Quantifizierung von Rohrnetzen.

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Representative Results

Maus 3B-11-Endothelzellen wurden auf verfestigtem reduzierte Wachstumsfaktor BME ausgesät - in diesem Assay das Produkt Matrigel wurde - und über die Zeit verfolgt. Wie in 1 gezeigt, sind in der Lage der Schlauchbildung zu induzieren über die Zeit angiogenen Faktoren entweder durch Maus-Keratinozyten oder Fibroblasten sezerniert. Endothelzellen migrieren und beginnen, kleine Äste in 1-2 h Beschichtung bilden. Maximaler Rohrbildung wurde durch 4-6 h mit zuvor aus Keratinozyten erhalten konditionierten Medien erreicht. Um 24 h, blieb einige Zweige, aber viele der Zellen wurde apoptotischen und Röhren begannen zu trennen.

Zellzahl hat tiefgreifende Auswirkungen auf die Schlauchbildung (Abbildung 2). Wenn eine nicht ausreichende Anzahl von Zellen auf der Matrix ausgesät paar Rohre zu bilden, und das Netz ist minimal. Da immer mehr Zellen ausgesät werden, wird das Rohr Netzwerk umfangreicher. Jedoch bei einer zu hohen Konzentration, beginnen die Zellen zu verklumpen oder zu bildenMonoschichten, und die Unterschiede zwischen den Behandlungsgruppen werden maskierten.

Schlauchbildung mit 3B-11-Zellen funktioniert am besten mit Zellen, die zwischen der zweiten und sechsten Passagen. Nach dem sechsten Durchgang, keine Zellen bilden so umfangreich ein Netzwerk; Zellen bilden keine größeren Netzwerk nach dem zehnten Durchgang. Zellen sollten mindestens zwei Durchgänge haben, nachdem die Wiederbelebung von Flüssigstickstofflager ausreichende Schlauchbildung (3) zu gewährleisten. Die Wachstumsrate der 3B-11 ist so schnell, dass 25% der Zellen passagiert eines Tages ergeben ein konfluenter Kanne am folgenden Tag.

Bilder können einfach durch Phasenkontrastmikroskopie mit Objektiven zwischen 4X und 20X dokumentiert werden. Jedoch, wenn Fluoreszenzbilder erwünscht sind, können Calcein AM hinzugefügt werden, und die Rohrleitungsnetz durch Fluoreszenz oder konfokalen Mikroskopie (4) sichtbar gemacht. Es gibt verschiedene Möglichkeiten, um zu detektieren und zu quantifizieren Rohrnetzwerkbildung. Die häufigste methods Analyse einbeziehen Quantifizierung der Anzahl der Rohre, Knoten, Schlaufen / Maschen, oder die Länge der Rohre. Diese Parameter können von Hand gezählt werden oder können über verschiedene Bildbearbeitungsprogrammen, wie NIH ImageJ mit der Angiogenese Analyzer Plugin erfolgen. Beispiele für jede dieser Arten der Analyse sind in Figur 4 gezeigt.

Figur 1
Figur 3B 1. Maus-11-Endothelzellen Schlauchbildung über die Zeit. Insgesamt 1 × 10 5 Zellen pro Well auf reduzierte Wachstumsfaktor BME mit 350 ul konditioniertes Medium von entweder Fibroblasten oder Keratinozyten beimpft. Rohrbildung wurde im Laufe von 24 Stunden aufgezeichnet.

Figur 2 < br /> Abbildung 2. Die Wirkung der Zellzahl auf Endothelzellen Röhrenbildung. 3B-11-Zellen wurden in Vertiefungen in Konzentrationen von 5 × 10 4 bis 2 × 10 5 mit 350 ul von Fibroblasten oder Keratinozyten-konditioniertes Medium und dann ausgesät über die Zeit verfolgt. Beachten Sie das Fehlen der Schlauchbildung in die Vertiefungen plattiert mit 5 x 10 4 Zellen und die Verdrängung der Zellen in den Vertiefungen plattiert mit 2 x 10 5 Zellen.

Figur 3
Abbildung 3. Die Wirkung von Durchgang Nummer auf Endothelzellen Schlauchbildung. Insgesamt 1 x 10 5 Zellen pro Well auf reduzierte Wachstumsfaktor BME bei Passage 0, 1 ausgesät oder 2. Röhrchen Bildung wurde vor dem Durchgang 2 zu sehen.

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Abbildung 4. Fluoreszenzmikroskopie-Bildgebung und Quantifizierung der Röhrenbildung. Vor Beginn des Assays können die endothelialen Zellen mit Calcein AM, um die Zellen unter Verwendung von Fluoreszenz-oder konfokale Mikroskopie sichtbar zu behandeln. Es wurden mehrere Verfahren angegeben zur Quantifizierung der gebildeten Rohrnetz, einschließlich Zählen der Anzahl der Rohre, Schleifen / Maschen Verzweigungsstellen / Knoten, oder die Länge der Rohre. Hier zeigen wir, wie NIH Bild J mit dem Angiogenese-Plugin-Software kann auf einem Calcein AM verwendet werden Buntrohrnetz (A) zum Gesamt Knoten (rot) erkennen / Rohren (pink) / Mesh (blau) in Kombination (B) und fusionierte Netzwerk auf (C). Darüber hinaus kann dieses Programm verwendet werden, um individuell Knoten (D), Rohre (E) zu detektieren, oder Gitter (F), die dann quantifiziert werden kann (G werden

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Discussion

Angiogenese ist sowohl in physiologischen und pathologischen Prozessen beteiligt sind. Studium der Mechanismen der Angiogenese beteiligt die Verwendung von Assays, die die Hauptschritte bei der Angiogenese rekapitulieren. Die Endothelzellen Rohr-Assay bietet mehrere Vorteile gegenüber anderen Tests. Es ist einfach zu Set-up, ist relativ kostengünstig, produziert Tubuli innerhalb von Stunden, und quantifizierbar ist. Ferner kann sie in 24 oder 96-Well-Platten durchgeführt werden, und können somit zur Hochdurchsatz-Screening verwendet werden, um Faktoren zu identifizieren, die zu stimulieren oder zu hemmen Angiogenese werden. Obwohl wir früher 3B-11 Maus-Endothelzellen für unsere Experimente kann der Test mit einer Vielzahl von humanen oder murinen Endothelzellen Linien, einschließlich HUVEC und SVEC geführt werden.

Um eine endotheliale Zellrohr Bildungstest durchführen, werden Endothelzellen mit konditionierten Medien, die pro oder anti-angiogene Faktoren enthält und über reduzierter Wachstumsfaktor Basalmembranmatrix vernickelt gemischt. Endothelial Zellen beginnen, sich innerhalb von 1 Stunde und Lumen-haltigen Tubuli beginnen, innerhalb von 2 h erscheinen auszurichten. Schlauchbildung kann unter Verwendung eines Phasenkontrastmikroskop sichtbar gemacht werden, invertiert oder Calcein AM kann am Ende des Assays und Röhren visualisiert unter Verwendung von Fluoreszenz oder konfokalen Mikroskopie aufgenommen werden.

Ergebnisse können in mehrfacher Hinsicht optimiert werden. Erstens sollte primären Zellen idealerweise zwischen der zweiten und sechsten Passagen sein. Verwendung von Zellen, vor dem zweiten und nach dem zehnten Durchgang ist nicht förderlich für maximale Schlauchbildung sein. Zweitens muss die Zellzahl auf der Grundlage von Zelltyp und Leitung optimiert werden. Für Maus 3B-11, fanden wir maximale Reaktion mit 75,000-100,000 Zellen / Well in einer 24-Well-Platte mit der Maus Keratinozyten und Fibroblasten-konditionierten Medien gewachsen. Verwendung von zu wenigen Zellen führt zu einer minimalen oder keiner der Schlauchbildung und zu viele Zellen zur Bildung einer Monoschicht oder Verklumpen. Schließlich sollte die Menge des konditionierten Medien eingesetzt normalized auf die Zellzahl anstelle der Proteinkonzentration. Bei Verwendung von normalem Medium mit 10% FBS, werden die FBS für die Mehrheit der Proteinkonzentration durch einen Standard-Protein-Assay gemessen ausmachen. Die Konzentration fast identisch aussehen, obwohl Anzahl von Zellen, und daher die Konzentration der Proteine ​​während Anlage abgesondert wird, zwischen den Behandlungen kann sehr variabel sein.

Zusammenfassend ist das Rohr-Assay eine schnelle, reproduzierbare und empfindliche Methode zur in vitro Messung der Angiogenese. Es hat Vorteile gegenüber anderen Assays und ist eine nützliche Methode, um Gene und Signalwege, die möglicherweise eine wichtige Rolle bei der Aktivierung oder Hemmung der Angiogenese spielen, zu bestimmen.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgments

Diese Forschung wurde zum Teil durch die Interne Research Program der National Cancer Institute an der National Institutes of Health, und NCI gewähren UA5CA152907.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Costar 24-well tissue culture-treated plate Corning 3524
BD Matrigel basement membrane matrix, growth factor reduced BD Biosciences 354230
Gibco 0.05% trypsin-EDTA Life Technologies 25300-054
Gibco L-glutamine 200 mM (100x) Life Technologies 25030-081
Gibco pen strep Life Technologies 15140-122
Gibco DMEM (1x) Life Technologies 11965-092
Gibco DPBS (1x) Life Technologies 14190-144
Fetal Bovine Serum Atlas Biologicals F-0500-A
Calcein AM Life Technologies C3100MP
DMSO ATCC 4-X

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DeCicco-Skinner, K. L., Henry, G. H., Cataisson, C., Tabib, T., Gwilliam, J. C., Watson, N. J., Bullwinkle, E. M., Falkenburg, L., O'Neill, R. C., Morin, A., Wiest, J. S. Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis. J. Vis. Exp. (91), e51312, doi:10.3791/51312 (2014).

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