Neonatal Pial Oberflächen Elektroporation
Summary
Die Pia-Oberfläche ist eine einzigartige Vorläuferzone im ZNS, die Aufnahme wird immer mehr Aufmerksamkeit. Hier erläutern wir ein Verfahren für schnelle genetische Manipulation dieser Vorläuferzone unter Verwendung einer modifizierten Methode der Elektroporation. Dieses Verfahren kann für zelluläre und molekulare Untersuchungen der Zelllinien und Signalwegen in der Zelldifferenzierung beteiligt sind, verwendet werden, um das Schicksal und die Eigenschaften von Tochterzellen zu erklären.
Abstract
In den vergangenen Jahren ist der Pia-Oberfläche wurde als Keim Nische von Bedeutung bei der Embryonalentwicklung, perinatale und Erwachsenen Neuro-und Gliogenese identifiziert worden, darunter nach der Verletzung. Allerdings Verfahren zur genetischen Abfrage diese Vorläufer Bevölkerung und die Verfolgung ihrer Abstammungslinien beschränkt hatte aufgrund einer mangelnden Spezifität oder zeitaufwendig Produktion von Viren. So hat die Fortschritte in diesem Bereich mit nur einer Handvoll von Untersuchungen dieser Lage relativ langsam. Elektroporation ist seit über einem Jahrzehnt in der postnatalen Gehirn eingesetzt, um neurale Stammzelleigenschaften im Embryo zu studieren, und in jüngerer Zeit. Hier beschreiben wir eine effiziente, schnelle und einfache Technik für die genetische Manipulation von Pia-Oberfläche Vorläuferzellen auf Basis eines angepassten Ansatz Elektroporation. Pia-Oberfläche Elektroporation ermöglicht einfache genetische Kennzeichnung und Manipulation dieser Vorläuferzellen und damit zu einer zeitsparende und wirtschaftliche Lösung für das Studium dieser Zellen.
Introduction
Neuralen Stamm-und Vorläuferzellen sind in der gesamten Säugetier-ZNS-1, 2. Art und Eigenschaften der embryonalen und adulten Keimzonen um die ventrikulären Regionen des Gehirns und des Rückenmarks sind ausführlich in den letzten zehn Jahren 1-3 dokumentiert. Zum großen Teil ist dies auf die Entwicklung von immer präzise genetische Werkzeuge, wie das Nervensystem spezifische Cre Rekombination von floxed Allele oder retroviral-Linie 4 Verfolgung gewesen. Allerdings ist eine Vorläuferregion-Pia-Oberfläche der Vorläufer-Zone hat erst vor kurzem im Detail 7.5 beschrieben und erwartet umfassende Untersuchung.
Der Pia-Oberfläche des Gehirns wird als die Schnittstelle zwischen der Oberfläche des Gehirns und der Hirnhaut umgebenden 8 definiert. Während der Entwicklung neuroepithelialen und später radiale Gliazellen Ende Füßen befestigen zu dieser Fläche 9,10. Einige der Tannest Neuronen im Gehirn und viele neuronale Mitosen in diesem Bereich 11 beobachtet. Später, während der embryonalen Neurogenese, kortikale Inter sind bekannt, die Pia-Region durchqueren, zusätzlich zu ihren Migrationsrouten in der Zwischenzone und Subventrikularzone 12-14. Während dieser Zeit können Stammzellen aus diesem Bereich kultiviert werden, und es scheint eine aktive Stelle des Neuro-und Gliogenese 5 sein. Im erwachsenen Gehirn, wurde berichtet, dass Inter kann von Pia-Oberfläche Vorfahren folgenden hypoxischen Herausforderung 7 geboren werden. Allerdings ist die Beteiligung der Region an, um seine während der embryonalen und postnatalen Entwicklung genensis hat obskuren Teil auf die Schwierigkeit, die speziell der Untersuchung dieser Region 6 geblieben. In den Colliculus superior und in der Großhirnrinde kann oberflächlich (oder Schicht I in der Rinde) Inter den Schaltungsausgang der zugrunde liegenden erregenden Neuronenpopulationen zu modulieren und damit beitragen significantly der Funktion dieser Strukturen. Insbesondere sind Schicht ein Inter in bester Lage, das Feuern von Neuronen in den oberen Schichten der Hirnrinde angesichts ihrer umfangreichen Konnektivität zu den oberflächlichen und tiefen Schichten der kortikalen Säulen 15,16 regulieren. In ähnlicher Weise erhalten horizontalen Inter erregenden Input von kortikalen und Netzhautfasern, Projekt über einen relativ weiten Bereich und spekuliert auf die Hemmung der neuronalen Populationen Reaktion auf visuelle Reize Fern 17,18 vermitteln. Auch ist ihre Morphologie gut geeignet, um eine mögliche Rolle in der strukturierten Wellenaktivität in den Entwicklungs visuelle System 19 spielen. Interessanterweise Intern Entwicklung und Reifung geschieht zu einem großen Teil postnatal. Ferner kann dieser Reifungsprozess wurde festgestellt, durch neuronale Aktivität reguliert werden und ist somit ein Substrat der Plastizität mit lebenslangen Folgen für Schaltungsfunktion 20,21. Insbesondere no Promotoren beschrieben, die gezielt können diese Zellen transgen. Die Aufteilung Vorfahren mit Retrovirus 7 richtet werden, aber die Virusproduktion ist zeitaufwendig und erfordert Geschick, um die hohe Titer für die Zellübertragung notwendig ergeben.
Elektroporation hat zu einer Renaissance in der Studie der Entwicklung des Nervensystems geführt, wie es ermöglicht eine schnelle und effiziente Abfrage der genetischen Signalwege in neuronalen Vorläuferzellen 4, 22, 23. Die Elektroporation umfasst die Injektion von Plasmid-DNA, gefolgt von der Abgabe von elektrischen Impulsen an die Außenseite des Kopfes, um in einer Richtung in die proliferierenden Vorläuferzellen umgibt die Kammern 4, 22, 23 treiben die DNA. Elektroporation scheint Transitzellen durch M-Phase des Zellzyklus für die Expression von Transgenen Plasmid 24 erforderlich. Insbesondere wurde gefunden, dass nurZellen, die durch M-Phase innerhalb von 8 Stunden der Elektroporation von Plasmiden wird Transgene trotz ihrer wirksamen Zustellung an alle Zellen innerhalb von ~ 160 um der Kammerwand 24 zum Ausdruck bringen. Es wird spekuliert, dass dies in Berücksichtigung Kern Zugang der episomalen Plasmiden aufgrund der Notwendigkeit für die Kernhülle Bruch, Chemikalien verursacht Kern Permeabilisierung kann die Expression von Plasmiden, die in der Post mitotischen Zellen 25 zu induzieren. Ursprünglich in der Embryo-22 verwendet, Elektroporation wurde für den Einsatz in der postnatalen Gehirn viel später 26, 27 angepasst. Kürzlich haben wir Elektroporation zur Verwendung bei der genetischen Manipulation von Pia-Oberfläche Vorläufer 6 angepasst. Weitere, mit diesem Ansatz haben wir gezeigt, dass es offenbar zwei verschiedene Linien der Vorfahren in dieser Region und Astrozyten-intern 6. Dieses Protokoll Details eine einfache, schnelle und leistungsfähige Methode, um diese Zellen für die Abfrage Zielder Mechanismen, die Entwicklung dieser Zellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der wichtigste Aspekt für die erfolgreiche Elektroporation von Pia-Oberfläche Vorläufer sind: 1) Targeting-Plasmid Mischung der Pia-Oberfläche; 2) Verhinderung der Entstehung von Hämatomen an der Injektionsstelle; und 3) die Vermeidung von Sterblichkeit, die mit Mittelhirn Elektroporation verbunden.
Geeigneter Ausrichtung der Pia-Oberfläche wird gemessen und sorgfältige Punktierung des Schädels erreicht, um das Eindringen der Pia-Oberfläche zu vermeiden. 1) Verschiebung der schnelle…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten die Unterstützung der Samuel Oschin Comprehensive Cancer Institute Cancer Research Forum Award sowie Mittel aus dem Institut für Regenerative Medizin Cedars-Sinai und der Guerin Familie anzuerkennen. Das beschriebene Projekt wurde in Form einer CTSI Core-Gutschein vom National Center for Research Resources, Grant UL1RR033176 finanziert unterstützt und ist jetzt in der National Center for Advancing Translational Sciences, Grant UL1TR000124. Der Inhalt ist ausschließlich der Verantwortung der Autoren und nicht notwendigerweise die offizielle Meinung des NIH.
Materials
| Item Name | Vendor | Catalog Number |
| Fire Polished Borosilicate Tubing | World Precision Instruments, Inc. | 1B100F-4 |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments Company | P-30 |
| Fast Green FCF | Sigma Aldrich, Inc. | F7528 |
| XenoWorks Digital Microinjector | Sutter Instruments Company | |
| ECM 830 Generator | Harvard Apparatus, BTX Instrument Div | 45-0052 |
| 3mm Platinum Tweezertrodes | Harvard Apparatus, BTX Instrument Div | 45-0487 |
| SignaGel Electrode Gel | Cardinal Health | 70315-025 |
| Tris-EDTA Buffer, pH 8.0 | Integrated DNA Technologies, Inc. | 11-01-02-05 |
| Infrared Heat Lamp | VWR | 36547-009 |
| Fine Scissors Sharp | Fine Science Tools | 14060-09 |
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