Neonatale Pial elettroporazione Surface
Summary
La superficie piale è una zona progenitore unico nel SNC che sta ricevendo crescente attenzione. Qui, noi dettaglio un metodo per la manipolazione genetica rapido di questa zona progenitore utilizzando un metodo di elettroporazione modificato. Questa procedura può essere utilizzata per indagini cellulari e molecolari delle linee cellulari e vie di segnalazione coinvolte nella differenziazione cellulare e per chiarire il destino e le proprietà delle cellule figlie.
Abstract
Negli ultimi anni la superficie piale è stato identificato come una nicchia germinale di importanza durante embrionale, perinatale e adulti neuro-e gliogenesi, compreso dopo l'infortunio. Tuttavia, i metodi per interrogare queste popolazioni geneticamente progenitrici e monitoraggio le loro linee erano limitate a causa della mancanza di specificità o tempo di produzione di virus. Così, i progressi in questa regione è stato relativamente lento con solo una manciata di ricerche di questa posizione. L'elettroporazione è stato utilizzato per oltre un decennio a studiare neurali proprietà delle cellule staminali nell'embrione, e più recentemente nel cervello postnatale. Qui si descrive una tecnica efficiente, rapido e semplice per la manipolazione genetica dei progenitori superficie piale basati su un approccio elettroporazione adeguato. Pial superficie elettroporazione consente per l'etichettatura genetica facile e manipolazione di questi progenitori, rappresentando così un approccio risparmio di tempo ed economico per lo studio di queste cellule.
Introduction
Cellule staminali e progenitrici neurali sono presenti in tutta la loro SNC 1, 2. La loro natura e le proprietà nelle zone germinali embrionali e adulte che circondano le regioni ventricolari del cervello e del midollo spinale sono stati ampiamente documentati negli ultimi dieci anni 1-3. In gran parte, ciò è dovuto allo sviluppo di strumenti genetici sempre più precisi, come il sistema nervoso specifico Cre ricombinazione degli alleli floxed e lignaggio retrovirale tracciamento 4. Tuttavia, una regione, il progenitore piale progenitore superficie di zona-ha solo stato recentemente descritto in dettaglio 5-7 e attende esame completo.
La superficie piale del cervello è definito come l'interfaccia tra la superficie del cervello e meningi circostanti 8. Durante lo sviluppo, neuroepiteliale e, più tardi, i piedi end gliali radiali attribuiscono a questa superficie 9,10. Alcuni di abetest neuroni nel cervello umano e molte mitosi neuronali si osservano in questa regione 11. Successivamente, durante la neurogenesi embrionale, interneuroni corticali sono noti per attraversare la regione piale, oltre alla loro rotte migratorie nella zona intermedia e zona subventricular 12-14. Durante questo periodo, le cellule staminali possono essere coltivate da questa zona e sembra di essere un sito attivo di neuro-e gliogenesi 5. Nel cervello adulto, è stato riportato che interneuroni possono nascere da progenitori superficie piale seguente sfida ipossica 7. Tuttavia, il contributo di questa regione al suo a genensis durante lo sviluppo embrionale e postnatale è rimasta oscura in parte a causa della difficoltà di specificamente indagare questa regione 6. In collicolo superiore e nella corteccia cerebrale, interneuroni superficiali (o layer I nella corteccia) possono modulare l'uscita del circuito di sottostanti popolazioni neuronali eccitatori e contribuire così significativaantly alla funzione di queste strutture. In particolare, lo strato 1 interneuroni sono in posizione privilegiata per regolare la scarica dei neuroni durante strati superiori della corteccia cerebrale data la loro ampia connettività agli strati superficiali e profondi di colonne corticali 15,16. In modo simile, gli interneuroni orizzontali ricevono input eccitatorio da fibre corticali e retiniche, progetto su un'area relativamente ampia e sono speculato per mediare l'inibizione di popolazioni di neuroni che rispondono a stimoli visivi remoto 17,18. Inoltre, la loro morfologia è adatto a svolgere un ruolo potenziale nell'attività onda modellata nel sistema visivo di sviluppo 19. È interessante notare che lo sviluppo degli interneuroni e maturazione avviene in larga misura dopo la nascita. Inoltre, questo processo di maturazione è stato trovato per essere regolata da attività neuronale ed è quindi un substrato di plasticità dello sviluppo con conseguenze per tutta la vita sulla funzione del circuito 20,21. In particolare, no promotori sono descritti che possono specificatamente indirizzare queste cellule transgenically. Progenitori dividono possono essere mirati con retrovirus 7, ma la produzione di virus è in termini di tempo e richiede abilità per ottenere i titoli elevati necessari per la trasduzione delle cellule.
Elettroporazione ha portato ad una rinascita nello studio di neurosviluppo in quanto consente una rapida ed efficace interrogatorio genetica delle vie di segnalazione in progenitori neurali 4, 22, 23. Elettroporazione comporta l'iniezione di DNA plasmidico, seguita dal rilascio di impulsi elettrici al di fuori della testa, per guidare unidirezionalmente il DNA nei progenitori proliferanti circondano i ventricoli 4, 22, 23. Elettroporazione sembra richiedere transito delle cellule attraverso fase M del ciclo cellulare per l'espressione dei transgeni plasmide 24. In particolare, si è scoperto che solocellule di passaggio di fase M entro 8 ore di elettroporazione di plasmidi esprimeranno transgeni nonostante una consegna efficace per tutte le celle all'interno di ~ 160 micron della parete ventricolare 24. Si dice che questo è dovuto alla necessità di ripartizione involucro nucleare nel consentire l'accesso nucleare dei plasmidi episomale, come sostanze chimiche che provocano permeabilizzazione nucleare possono indurre l'espressione di plasmidi in cellule post mitotiche 25. Originariamente impiegato nell'embrione 22, elettroporazione è stato adattato per l'uso nel cervello postnatale molto più tardi 26, 27. Recentemente, abbiamo adattato elettroporazione per l'uso nella manipolazione genetica di progenitori superficie piale 6. Inoltre, con questo metodo abbiamo dimostrato che ci sono apparentemente due linee distinte di progenitori in questa regione-interneuronale e astrocitaria 6. Dettagli Questo protocollo un modo semplice, rapido e potente per indirizzare queste cellule per l'interrogazionelo sviluppo di meccanismi di regolazione di queste cellule.
Protocol
Representative Results
Discussion
L'aspetto più critico per il successo elettroporazione di cellule progenitrici superficie piale sono: 1) il targeting di mix plasmide alla superficie piale; 2) evitare la generazione di ematomi nel sito di iniezione; e 3) evitando la mortalità associate con elettroporazione mesencefalo.
Opportunamente mira la superficie piale si ottiene punzonamento misurata e attenta del cranio per evitare la penetrazione della superficie piale. Improprio di targeting per la pelle sovrastante o sottos…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare il sostegno del Forum Cancer Institute Cancer Research Award Samuel Oschin globale così come i fondi presso l'Istituto di Medicina Rigenerativa del Cedars-Sinai, e la famiglia Guerin. Il progetto descritto è stato sostenuto nella forma di un CTSI Nucleo Voucher finanziato dal Centro Nazionale per le Risorse della Ricerca, Grant UL1RR033176, ed è ora presso il Centro Nazionale per l'Avanzamento delle Scienze traslazionale, di Grant UL1TR000124. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del NIH.
Materials
| Item Name | Vendor | Catalog Number |
| Fire Polished Borosilicate Tubing | World Precision Instruments, Inc. | 1B100F-4 |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments Company | P-30 |
| Fast Green FCF | Sigma Aldrich, Inc. | F7528 |
| XenoWorks Digital Microinjector | Sutter Instruments Company | |
| ECM 830 Generator | Harvard Apparatus, BTX Instrument Div | 45-0052 |
| 3mm Platinum Tweezertrodes | Harvard Apparatus, BTX Instrument Div | 45-0487 |
| SignaGel Electrode Gel | Cardinal Health | 70315-025 |
| Tris-EDTA Buffer, pH 8.0 | Integrated DNA Technologies, Inc. | 11-01-02-05 |
| Infrared Heat Lamp | VWR | 36547-009 |
| Fine Scissors Sharp | Fine Science Tools | 14060-09 |
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