Une microplaque de dosage rapide et spécifique pour la détermination de l'ascorbate intra-et extracellulaire dans les cellules cultivées

Summary

Ascorbate joue de nombreux rôles importants dans le métabolisme cellulaire, dont beaucoup ont seulement mis en lumière au cours des dernières années. Nous décrivons ici un débit moyen, dosage de microplaques spécifique et peu coûteux pour la détermination de l'ascorbate à la fois intra-et extra-cellulaire dans une culture cellulaire.

Abstract

La vitamine C (ascorbate) joue de nombreux rôles importants dans le métabolisme cellulaire, dont beaucoup ont seulement venir à la lumière au cours des dernières années. Par exemple, dans le cerveau, l'ascorbate agit d'une manière neuroprotecteur et neuromodulateur qui implique vélo ascorbate entre les neurones et les astrocytes vicinaux – une relation qui semble être essentiel pour le cerveau ascorbate homéostasie. En outre, la preuve émergente suggère fortement que l'ascorbate a un rôle considérablement élargi dans la régulation du métabolisme du fer cellulaire et systémique que classiquement reconnu. La reconnaissance croissante du rôle intégrante de l'ascorbate dans la physiologie cellulaire et organismique normale et déréglementé exige une gamme de moyen-débit et haute sensibilité des techniques analytiques qui peuvent être exécutées sans avoir besoin d'équipement spécialisé très coûteux. Ici, nous fournissons des instructions explicites pour un débit moyen, essai de microplaques spécifique et relativement peu coûteux pour la détermination de boe ascorbate intra-et extra-cellulaire dans une culture cellulaire.

Introduction

La découverte de la nature chimique de l'acide ascorbique (vitamine C), et son identification comme le «facteur anti-scorbutique" longtemps cherché, par Albert Szent-Györgyi et d'autres dans les documents publiés de 1928 à 1934 ¹ étaient événements marquants dans l'histoire de la biochimie. En effet, ces découvertes ont contribué à Szent-Györgyi est attribué le prix Nobel de physiologie ou médecine en 1937. L'ensemble toujours croissant de rôles pour l'ascorbate en physiologie animale et végétale, ainsi que la santé humaine, continuent à être les sujets de scientifique active enquête et de controverse.

L-ascorbate est un réducteur physiologique abondante et cofacteur enzymatique dans des systèmes de mammifères, et contribue à de nombreuses réactions enzymatiques impliquant bien définies hydroxylation du collagène, de la carnitine et de la norépinéphrine la biosynthèse, le métabolisme de la tyrosine et de l'hormone de peptide amidation ^2. Curieusement, evide de montagence suggère que l'ascorbate joue un rôle dans la stimulation d'autres dioxygénases de fer-dépendants, tels que les hydroxylases prolyl et asparaginyle impliquées dans le ciblage et l'hydroxylation des facteurs inductibles par l'hypoxie (HIF) et 1α 2α ^3. Un rapport récent suggère que l'ascorbate joue un rôle dans la maturation des lymphocytes T en affectant la chromatine déméthylation via son activité en stimulant les hydroxylases nucléaires, Jumonji C (JmjC) protéines de domaine; ce dernier qui semble exiger ascorbate de pleine activité ^4. En effet, la stimulation de ces enzymes par ascorbate semble se produire par un mécanisme similaire à la stimulation par l'ascorbate de collagène et les HIF hydroxylases. Parmi d'autres effets classiques, ascorbate contribue de manière significative à l'anti-oxydation cellulaire en tant que chaîne de tomber en piégeur de radicaux soluble dans l'eau ⁵ et au recyclage de la membrane plasmique α-tocophérol (vitamine E) par l'intermédiaire de la réduction du radical α-tocophéroxyles ^6, which est important dans la protection contre peroxydation des lipides membranaires ^7. Il est important, bien que la plupart des mammifères sont capables de novo la synthèse hépatique de l'ascorbate de D-glucose, les primates supérieurs, des cobayes et des chauves-souris dépendent de sources alimentaires de vitamine ^8. Cela est dû à l'inactivation du gène GULO, les orthologues de non affectées chez les mammifères qui codent pour l'enzyme, γ-gulono-lactone oxydase ^9-13. Cette enzyme est requise pour la réaction finale dans la biosynthèse de l'ascorbate de ¹³ glucose.

Après absorption de transporteur à médiation par de la lumière intestinale chez l'homme, l'ascorbate est distribué dans tout le corps par le système circulatoire. La vitamine se trouve généralement dans sa forme réduite à des concentrations millimolaires intracellulaire (à l'exception notable des érythrocytes dans laquelle les concentrations sont généralement similaires à la concentration plasmatique en vigueur), et au concentré micromolesentrations (par exemple 50-200 pM) dans la plupart des liquides extracellulaires ^14,15.

Dans des conditions physiologiques, l'ascorbate subit typiquement une oxydation à un électron réversible au radical ascorbyle libre (AFR, également connu sous le nom monodehydroascorbate ou semidehydroascorbate). Alors que l'AFR est un radical relativement stable ^16, en l'absence de son rapide à un électron réduction enzymatique de retour à l'ascorbate, deux RAS peut encore dismuter à un ascorbate et un déshydroascorbate (DHA) ^9,13,17. A l'intérieur de la cellule, le produit d'oxydation à deux électrons de l'ascorbate, le DHA, peut être rapidement ramené en arrière à l'ascorbate et de la glutathion-NAD (P) H-enzymatique de charge et des réactions non enzymatiques ^13.

S'il est classiquement admis que seulement le rôle important de l'ascorbate dans le métabolisme du fer est de stimuler l'absorption alimentaire de fer non hémique ^18, nous et d'autres avons fourni des preuves dece qui suggère que l'ascorbate trongly joue un rôle considérablement élargi dans le métabolisme de ce métal. Tout d'abord, l'ascorbate qui est libérée par les cellules de l'ascorbate-remplie semble jouer un rôle important dans la modulation de l'absorption du fer non lié à la transferrine par les cellules ^19,20, et la preuve très récente indique que l'ascorbate module également l'absorption du fer lié à la transferrine par des cellules ^21, cette dernière, qui correspond à une importante absorption physiologique de fer-voie ^22.

Ascorbate est essentiel pour la fonction normale du système nerveux central chez les mammifères ^23,24. En collaboration avec le cortex, de l'hypophyse, du thymus, de la rétine et du corps jaune surrénale, le cerveau contient des concentrations élevées de l'ascorbate par rapport à d'autres tissus de l'organisme ^23,25-27. De plus, l'exposition à la fois les astrocytes et les cellules ^28,29 analogues à des neurones ³⁰ de glutamate est connu pour déclencher la libération de l'ascorbate dans l'espace extracellulaire, où l'ascorbatee est pensé pour aider à protéger les neurones contre la dysfonction neuronale induite par le glutamate ^31. Bien que le mécanisme exact de induite par le glutamate-ascorbate de presse des astrocytes est inconnue, nous avons récemment apporté des preuves indiquant l'implication de la cellule gonflement causé par une capture de glutamate par le glutamate des astrocytes et de l'aspartate transporteur (GLAST, également appelée acide aminé excitateur transporteur isoforme 1 [EAAT1 ] chez l'homme) et l'activation consécutive de osmolyte et d'anions canaux de volume sensible (VSOACs) qui sont perméables à de petits anions organiques tels que l'ascorbate ^32. Les identités moléculaires des conduits de membranes plasmatiques impliquées dans la formation VSOAC restent à identifier ^33,34.

Bien que de nombreux essais ont été développées pour la détermination de l'ascorbate dans des échantillons biologiques, qui comprennent les dosages spectrophotométriques, fluorimétriques et ^35,36 chromatographiques, il existe une grande variabilité dans la spécificité, la sensibilité, interference par les contaminants chimiques, la gamme linéaire efficace et la stabilité de l'analyte du point de terminaison. En outre, d'autres facteurs importants qui influent sur le choix de test sont la rapidité, la facilité d'utilisation et l'accès à un équipement relativement spécialisé, comme une chromatographie liquide à haute performance (CLHP) appareil.

Ici, nous présentons un dosage simple et hautement spécifique microplaque colorimétrique pour la détermination de l'ascorbate intracellulaire dans des cellules cultivées, ainsi que d'un essai séparé pour la détermination de l'ascorbate-efflux de cellules en culture. Le dernier test a pour but de contourner le problème de la sous-estimation de l'ascorbate de presse à partir de cellules en raison de ré-absorption rapide de l'ascorbate libéré par les transporteurs d'ascorbate de sodium-dépendant (SVCTs). Bien que ces deux méthodes ont fait leur apparition dans certaines de nos publications précédentes ^{19,20,32,37,38,} ce manuscrit fournit un ensemble explicite des instructions et des lignes directrices pour leur exécution effective.

Protocol

1. Déterminer ascorbate intracellulaire dans les cellules cultivées culture cellulaire et la récolte Cultivez suspension (par exemple érythroleucémique humaine, K562) ou des cellules adhérentes (par exemple, les astrocytes primaires) en utilisant des procédures standard de culture 19-21,32,38. Remarque: pour assurer cellules contiennent ascorbate, charger les cellules en culture avec de l'ascorbate soit comme l'ascorbate ou DHA 33,39.<…

Representative Results

Détermination de l'ascorbate intracellulaire dans les cellules de suspension de culture Dans le premier essai (figure 1), l'ascorbate intracellulaire est déterminée, à la suite de l'ascorbate-spécifique (c.-à-AO-sensible) la réduction du ferricyanure en ferrocyanure, à l'aide de la détermination hautement sensible de ferrocyanure par un mode opératoire déjà publié 37. La détection de l'ascorbate est basée sur la colorimétr…

Discussion

Dans ce document, nous présentons deux dosages colorimétriques des microplaques rapides, précis et relativement sensibles pour la détermination de l'ascorbate dérivé de compartiments intra-et extracellulaires dans les cellules cultivées. Les analyses peuvent être complétées par l'accès aux équipements et réactifs de laboratoire standard. Le réactif que modérément coûteux requis pour le dosage est AO, qui est essentielle, car elle donne un degré élevé de spécificité analyte vers <span class=…

Materials

Nunc 96-well flat-bottom plates	Thermo	269620	Any flat-bottom 96-well plate can be used
Refrigerated benchtop microcentrifuge	Eppendorf	5415D	A non-refrigerated microcentrifuge that has been equilibrated to temperature in a cold room can also be used
Refrigerated bench-top centrifuge	Eppendorf	5810R	Swing-bucket
Bio-Rad Benchmark Plus Microplate Spectrophotometer	Bio-Rad		Any microplate spectrophotometer capable of reading at 593 nm can be used and is recommended. If a filter-based plate reader is used, choose the closest wavelength possible and use the standard-curve method.
Ependorf MixMate (microplate orbital mixer)	Eppendorf		This is a very versatile and reliable microplate mixer and works very well for these assays
General-purpose buffers
Phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4
MOPS-buffered saline (MBS); 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 15 mM MOPS-Na+, pH 7.3
MBS + 5 mM D-glucose (MBS/D)
HEPES-buffered saline + 5 mM D-glucose (HBS/D); 137 mM NaCl, 5.2 mM KCl, 1.8 mM CaCl2•2 H2O, 0.8 mM MgSO4•7 H2O, 5 mM D-glucose, 20 mM HEPES-Na+, pH 7.3)
Cell permeabilisation buffer (CPB; 0.1% saponin in PBS)
General chemicals
L-ascorbic acid or sodium L-ascorbate	Sigma-Aldrich		Highest purity preparations should be obtained
Dehydro-L-ascorbic acid (DHA) dimer	Sigma-Aldrich	30790	Aqueous solutions theoretically yield 2 moles of DHA monomer per mole of DHA dimer
Cytochalasin B	Sigma-Aldrich	C6762	Stock solutions prepared in DMSO or ethanol
Ascorbate oxidase (AO)	Sigma-Aldrich	A0157	Stock solutions (120 U/ml) can be prepared in PBS or MBS and then frozen in aliquots
Potassium ferricyanide (FIC)	Sigma-Aldrich	455989	Trihydrate
Ferene-S (3-(2-Pyridyl)-5,6-di(2-furyl)-1,2,4-triazine-5′,5′′-disulfonic acid disodium salt)	Sigma-Aldrich	92940
Sodium L-glutamate	Sigma-Aldrich
L-glutamine	Sigma-Aldrich
Saponin	Sigma-Aldrich	47036	Prepare a 0.1% stock solution
Stock solutions for intracellular ascorbate determination assay
3 M sodium acetate (pH 6.0)
Glacial acetic acid
0.2 M citric acid
3.3 mM FeCl3 in 0.1 M acetic acid
30 mM ferene-S
50% (v/v) acetic acid + 30% (w/v) trichloroacetic acid (TCA)
Stock solutions for ascorbate-efflux assay
AO (120 U/ml)
2.4 mM ferene-S
0.12 mM FeCl3 in 0.6 mM sodium-citrate