Быстрое и Удельный Микропланшетный Анализ для определения внутри-и внеклеточной аскорбат в культивируемых клетках

Summary

Аскорбат играет многочисленные важные роли в клеточном метаболизме, многие из которых только вышли на свет в последние годы. Здесь мы опишем средне-пропускную способность, конкретное и недорогой микропланшетного анализ для определения как внутри-и внеклеточной аскорбиновой кислоты в клеточной культуре.

Abstract

Витамин С (аскорбиновая кислота) играет многочисленные важные роли в клеточном метаболизме, многие из которых только приходят на свет в последние годы. Например, в головном мозге, аскорбиновая кислота действует в нейропротективного и нейромодуляторного образом, что включает в себя аскорбат велосипеде между нейронами и вицинальных астроцитов – отношения, которые, как представляется, решающее значение для мозга аскорбат гомеостаза. Кроме того, новые данные наводит на мысль, что аскорбиновая кислота имеет значительно расширенную роль в регуляции клеточного и системного метаболизма железа, чем в классическом признается. Растущее признание интегральной роли аскорбиновой кислоты в нормальной и разрегулированной клеточном и организменном физиологии требует ряд средне-пропускной и высокочувствительных аналитических методов, которые могут быть выполнены без необходимости сильно дорогой специального оборудования. Здесь мы предлагаем четкие инструкции для средней пропускной, конкретные и относительно недорогой микропланшетного анализ для определения бой внутри-и внеклеточной аскорбиновая кислота в клеточной культуре.

Introduction

Открытие химической природы аскорбиновой кислоты (витамин С), и его идентификации в качестве долгожданного "антицинготными фактора», Альберт Сент-Дьерди и другие в статьях, опубликованных с 1928 по 1934 ¹ были знаковые события в истории биохимии. В самом деле, эти открытия способствовали Сент-Дьерди присуждением Нобелевской премии по физиологии и медицине в 1937 году. Постоянно расширяющийся набор ролей для аскорбиновой кислоты в животных и физиологии растений, а также на здоровье человека, по-прежнему являются субъекты активная научная Расследование и споры.

L-аскорбат является обильное физиологический восстановитель и кофактор фермента в системах млекопитающих, и вносит свой ​​вклад в многочисленных хорошо определенных ферментативных реакций с участием коллагена гидроксилирование, карнитин и норадреналина биосинтез, метаболизм и тирозина пептидного гормона, амидирование ^2. Интересно, монтаж evideNCE предполагает, что аскорбат играет важную роль в стимулировании других железа зависит от диоксигеназ, такие как пролил и аспарагинила гидроксилазы, вовлеченных в гидроксилирование и ориентации из гипоксии-индуцируемых факторов (ОПО) 1α 2α и ^3. В недавнем докладе о том, что аскорбиновая кислота играет важную роль в Т-клеточной созревания до влияние хроматина деметилирования через его деятельности в стимулировании ядерных гидроксилаз, Jumonji C (JmjC) белки домена; последний из которых, кажется, требуют аскорбат для полноценной деятельности ^4. Действительно, стимуляция таких ферментов по аскорбат-видимому, происходит такой же механизм для стимуляции аскорбата из HIF и коллагеновых гидроксилазы. Среди других классических эффектов, аскорбат вносит значительный вклад в клеточной антиоксидантной качестве водорастворимого цепи разорвать акцептора радикалов ⁵ и утилизации плазматической мембраны α-токоферол (витамин Е) через снижению α-tocopheroxyl радикал ^6, шHICH играет важную роль в защите от перекисного окисления липидов мембраны ^7. Важно отметить, что хотя большинство млекопитающих способны процессов нового печени синтеза аскорбиновой кислоты из D-глюкозы, высшие приматы, морские свинки и некоторые летучие мыши зависит от пищевых источников витамина ^8. Это связано с инактивации гена Gulo, то ортологи которых в незатронутых млекопитающих кодирует фермент, γ-лактон gulono-оксидазы ^9-13. Этот фермент необходим для окончательного реакции в аскорбат биосинтеза глюкозы из ^13.

После транспортера-опосредованной всасывания из просвета кишечника в организме человека, аскорбиновая кислота распространяется по всему телу по кровеносной системе. Витамин обычно можно найти в восстановленной форме в миллимолярных концентрации внутри клеток (с исключением эритроцитов, в которых концентрации обычно похож на преобладающей концентрации в плазме), и в микромолярном концentrations (например 50-200 мкМ) в большинстве внеклеточных жидкостях ^14,15.

В физиологических условиях, аскорбиновая кислота обычно претерпевает обратимое одноэлектронную окисление в аскорбил свободных радикалов (AFR, также известный как monodehydroascorbate или semidehydroascorbate). В то время как AFR является относительно стабильный радикал ^16, в отсутствие его быстрого одноэлектронного снижению ферментативной обратно в аскорбат, два AFRs может дополнительно dismutate одному аскорбата и один дегидроаскорбат (DHA) ^9,13,17. В внутрь клетки, окисление продукта двухэлектронного аскорбата, DHA, могут быть быстро снижается обратно в аскорбат на глутатион-и NAD (P) H-зависимой ферментной и не ферментативных реакций ^13.

В то время как в классическом принято считать, что только значительную роль аскорбиновой кислоты в метаболизме железа является стимулирование диетическое всасывание не тема железа ^18, мы и другие предоставили доказательств сtrongly предполагая, что аскорбат играет значительно более значительную роль в метаболизме этого металла. Во-первых, аскорбат, который высвобождается аскорбата-изобилует клеток по-видимому, играют важную роль в модуляции поглощения не-трансферрином железа связаны клетками ^19,20, и совсем недавно данные показывают, что аскорбиновая кислота также модулирует поглощение трансферрином железа неизбежно ²¹ клетками, последний из которых соответствует основным физиологическим захватывающие железо маршрута ^22.

Аскорбат необходим для нормального центральной нервной системной функции у млекопитающих ^23,24. Вместе с коры надпочечников, гипофиза, вилочковой, сетчатки и желтого тела, мозг содержит высокие концентрации аскорбата по отношению к другим тканям организма ^23,25-27. Кроме того, воздействие как астроциты ^28,29 и нейроноподобных элементов ³⁰ на глутамат, как известно, вызывают высвобождение аскорбата во внеклеточное пространство, где ascorbatе, как полагают, чтобы помочь защитить нейроны против индуцированной глутаматом нейронов дисфункции ^31. В то время как точный механизм глутамат-индуцированный аскорбат выхода из астроцитов неизвестно, недавно мы представили доказательства, указывающий участие клетки опухоль, вызванная захвата глутамата на астроцитов глутамата и аспартата транспортера (GLAST, также известный возбуждающих аминокислот транспортер изоформы 1 [EAAT1 ] у людей) и, как следствие активация объема чувствительных осмолита и анионных каналов (VSOACs), которые проницаемы для малых органических анионов, таких как аскорбиновая кислота ^32. Молекулярные тождества плазменных мембранных каналов, участвующих в образовании VSOAC остаются должны быть определены ^33,34.

Хотя многие тесты были разработаны для определения аскорбиновой кислоты в биологических образцах, которые включают в спектрофотометрических, флуорометрические и хроматографические анализы ^35,36, есть много изменчивость в специфичности, чувствительности, interferencэ на химических загрязнителей, эффективного линейного диапазона и стабильности аналита конечной точки. Кроме того, другие важные факторы, влияющие на выбор анализа являются быстрота, простота в использовании и доступ к относительно специализированного оборудования, таких как жидкостной хроматографии высокоэффективной (ВЭЖХ) аппарата.

Здесь мы приводим простой и очень специфический колориметрический микропланшет-анализ для определения внутриклеточного аскорбата в культивируемых клетках, а также в качестве отдельного анализа для определения аскорбат-отток из культивируемых клеток. Последний анализ направлен на обойти проблему недооценки аскорбат освобождение от клеток из-за быстрого обратного захвата высвобожденного аскорбата по транспортеров аскорбата натрия (в зависимости от SVCTs). Хотя оба этих метода появились в некоторых из наших предыдущих публикаций ^{19,20,32,37,38,} эта рукопись обеспечивает явное набор инструкций и руководящих принципов для их эффективного выполнения.

Protocol

1. Определите внутриклеточных аскорбиновая кислота в культивируемых клетках Клеточная культура и сбор урожая Расти суспензии (например эритролейкемии человека, К562) или прилипшие клетки (например, первичные астроциты) с использованием стандартных процед?…

Representative Results

Определение внутриклеточного аскорбат в культуре клеток суспензии В первом тесте (рис. 1), внутриклеточный аскорбат определяется после аскорбат конкретным (т.е. АО-чувствительных) уменьшение феррицианида чтобы ферроцианид, используя высокочувствительный о…

Discussion

В этой статье мы представляем два быстрых, конкретных и относительно чувствительных колориметрических микропланшета тесты для определения аскорбиновой кислоты, полученной из внутри-и внеклеточных отсеков в культивируемых клетках. Анализы могут комплектоваться доступа к стандартны…

Materials

Nunc 96-well flat-bottom plates	Thermo	269620	Any flat-bottom 96-well plate can be used
Refrigerated benchtop microcentrifuge	Eppendorf	5415D	A non-refrigerated microcentrifuge that has been equilibrated to temperature in a cold room can also be used
Refrigerated bench-top centrifuge	Eppendorf	5810R	Swing-bucket
Bio-Rad Benchmark Plus Microplate Spectrophotometer	Bio-Rad		Any microplate spectrophotometer capable of reading at 593 nm can be used and is recommended. If a filter-based plate reader is used, choose the closest wavelength possible and use the standard-curve method.
Ependorf MixMate (microplate orbital mixer)	Eppendorf		This is a very versatile and reliable microplate mixer and works very well for these assays
General-purpose buffers
Phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4
MOPS-buffered saline (MBS); 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 15 mM MOPS-Na+, pH 7.3
MBS + 5 mM D-glucose (MBS/D)
HEPES-buffered saline + 5 mM D-glucose (HBS/D); 137 mM NaCl, 5.2 mM KCl, 1.8 mM CaCl2•2 H2O, 0.8 mM MgSO4•7 H2O, 5 mM D-glucose, 20 mM HEPES-Na+, pH 7.3)
Cell permeabilisation buffer (CPB; 0.1% saponin in PBS)
General chemicals
L-ascorbic acid or sodium L-ascorbate	Sigma-Aldrich		Highest purity preparations should be obtained
Dehydro-L-ascorbic acid (DHA) dimer	Sigma-Aldrich	30790	Aqueous solutions theoretically yield 2 moles of DHA monomer per mole of DHA dimer
Cytochalasin B	Sigma-Aldrich	C6762	Stock solutions prepared in DMSO or ethanol
Ascorbate oxidase (AO)	Sigma-Aldrich	A0157	Stock solutions (120 U/ml) can be prepared in PBS or MBS and then frozen in aliquots
Potassium ferricyanide (FIC)	Sigma-Aldrich	455989	Trihydrate
Ferene-S (3-(2-Pyridyl)-5,6-di(2-furyl)-1,2,4-triazine-5′,5′′-disulfonic acid disodium salt)	Sigma-Aldrich	92940
Sodium L-glutamate	Sigma-Aldrich
L-glutamine	Sigma-Aldrich
Saponin	Sigma-Aldrich	47036	Prepare a 0.1% stock solution
Stock solutions for intracellular ascorbate determination assay
3 M sodium acetate (pH 6.0)
Glacial acetic acid
0.2 M citric acid
3.3 mM FeCl3 in 0.1 M acetic acid
30 mM ferene-S
50% (v/v) acetic acid + 30% (w/v) trichloroacetic acid (TCA)
Stock solutions for ascorbate-efflux assay
AO (120 U/ml)
2.4 mM ferene-S
0.12 mM FeCl3 in 0.6 mM sodium-citrate