إعادة تشكيل β-catenin تدهور في<em> القيطم</em> مستخلصات البيض
Summary
ووصف طريقة لتحليل تدهور البروتين باستخدام رديولبلد والبروتينات luciferase المراسل الانصهار في القيطم استخراج البيض والتكيف من أجل الفرز الفائق الإنتاجية للجهري جزيء صغير من تدهور البروتين.
Abstract
القيطم المورق استخراج البيض هو، نظام قوي يتميز جيدا لدراسة الكيمياء الحيوية من العمليات الخلوية المختلفة. وقد استخدمت القيطم استخراج البيض لدراسة دوران البروتين في العديد من السياقات الخلوية، بما في ذلك دورة الخلية ومسارات نقل الإشارة 1-3. هنا، يتم وصف طريقة لعزل القيطم استخراج البيض الذي تم الأمثل لتعزيز تدهور المكون مسار WNT الحرجة، β-catenin. يتم وصف طريقتين مختلفتين لتقدير β-catenin تدهور البروتين في البيض القيطم استخراج. أسلوب واحد هو بالمعلومات بصريا ([35 S]-رديولبلد البروتينات)، في حين أن الآخر يتم تحجيم بسهولة أكبر لفحوصات عالية الإنتاجية (يراعة luciferase المراسل الموسومة البروتينات الانصهار). الأساليب المذكورة يمكن استخدامها ل، ولكن ليس على سبيل الحصر، تقييم β-catenin البروتين دوران وتحديد المكونات الجزيئية التي تسهم في حجم اعمالها. بالإضافة إلى ذلك، أبيإيتي لتنقية كميات كبيرة من متجانسة القيطم استخراج البيض جنبا إلى جنب مع قراءات الكمية والسهل من البروتينات الموسومة luciferase المراسل يسمح هذا النظام ليتم تكييفها بسهولة للكشف عن الإنتاجية العالية للجهري من تدهور β-catenin.
Introduction
وقد استخدم القيطم المورق استخراج البيض على نطاق واسع لدراسة العديد من العمليات البيولوجية الخلية بما في ذلك ديناميات هيكل الخلية، والتجمع النووية والاستيراد، وموت الخلايا المبرمج، والتمثيل الغذائي اليوبيكويتين، تقدم دورة الخلية، نقل الإشارة، والبروتين دوران 1-17. والقيطم البيض استخراج النظام قابلة للتحليل كيميائي حيوي من حشد غفير من العمليات الخلوية لاستخراج البيض يمثل أساسا السيتوبلازم غير مخفف يحتوي على كافة مكونات حشوية الأساسية اللازمة لتنفيذ هذه العمليات وتمكين التحقيق. كميات كبيرة من استخراج البيض يمكن أن تكون على استعداد في وقت واحد للتلاعب البيوكيميائية التي تتطلب كميات كبيرة من المواد (على سبيل المثال، وتنقية البروتين أو الفرز الفائق الإنتاجية) 18-20. ميزة أخرى هي أن تركيز بروتينات معينة في القيطم استخراج البيض يمكن تعديلها على وجه التحديد عن طريق إضافة المؤتلف البروتين و / أو immunodepletion من endogالبروتينات enous على النقيض من ترنسفكأيشن من الحمض النووي البلازميد حيث التعبير عن بروتين من الفائدة من الصعب السيطرة عليها. بالإضافة إلى ذلك، عدم وجود البروتينات المؤتلف متوفرة ويمكن التغلب عليها عن طريق إضافة نصوص ترميز البروتين من الفائدة، والاستفادة من قدرة الطازجة القيطم استخراج البيض العالية لترجمة مرنا وأضاف خارجيا.
تنظيم تدهور البروتين أمر بالغ الأهمية من أجل السيطرة على العديد من مسارات الخلوية والعمليات 21. وقد استخدم على نطاق واسع القيطم استخراج البيض لدراسة تدهور البروتين كما يسمح النظام عن طرق متعددة لرصد دوران البروتين دون التأثيرات الخلط بين النسخ والترجمة. إشارات مسار WNT هو مسار الإشارات حفظا للغاية أن يلعب أدوارا حاسمة في تطوير والمرض. دوران β-catenin، والمستجيب الرئيسية للمسار WNT، ودرجة عالية من التنظيم، وزادت حالة استقرار لترايفل من β-catenin هو أمر حاسم لتفعيل الجينات المستهدفة WNT. وسلط الضوء على أهمية تدهور β-catenin من حقيقة أن الطفرات في مسار WNT التي تمنع تدهور β-catenin جدت في ~ 90٪ من جميع حالات متفرقة من سرطان القولون والمستقيم 22. تدهور β-catenin بواسطة مكونات من مسار WNT يمكن تلخيصها بإخلاص في استخراج البيض القيطم لدراسة آلية من حجم اعمالها، وكذلك لتحديد جهري جزيء صغير الرواية من تدهورها 2، 19، 20، 23-29.
وقد وصفت وسائل لإعداد القيطم استخراج البيض لدراسة دورة الخلية في المنشورات السابقة إن الرب 30-32. يصف البروتوكول الحالي لتعديل هذه الأساليب والأمثل لتدهور [35 S]-β-رديولبلد catenin والموسومة luciferase المراسل β-catenin فيالقيطم استخراج البيض. تدهور فحص رديولبلد يسمح للرؤية مباشرة من مستويات البروتين عن طريق تصوير الإشعاع الذاتي. أدرج [35 S] ميثيونين في البروتين من الفائدة باستخدام ترجمة رد فعل في المختبر التي يمكن بعد ذلك إضافتها مباشرة إلى رد فعل تدهور. بالإضافة إلى ذلك، لا يتطلب البروتين رديولبلد دوران فحص الأجسام المضادة ضد البروتين من الفائدة أو علامة حاتمة، والتي يمكن أن تؤثر على استقرار البروتين. لأنه حتى التغيرات الصغيرة في مستويات البروتين، كما يتجلى في التغيرات في كثافة البروتين رديولبلد الفرقة، وتصور بسهولة عن طريق تصوير الإشعاع الذاتي، و[35 S]-رديولبلد يمثل تدهور فحص وسيلة مفيدة جدا لرؤية بروتين دوران 2.
انصهار β-catenin ليراعة luciferase (المشار إليها فيما يلي باسم ببساطة "luciferase المراسل") يسمح لقياس الكمي الدقيق والسهل من مستويات البروتين، من أجللتحديد الخصائص الحركية للβ-catenin دوران 19، 20. والميزة الرئيسية للمقايسة luciferase المراسل هو أنه يوفر نظام كمي قوية على أن يتم تحجيم بسهولة. يوفر بروتوكول التالية أساليب بسيطة لمعايرة تدهور β-catenin وطريقة قوية وفعالة، وفعالة لالفرز الفائق الإنتاجية من رواية جهري β-catenin.
Protocol
Representative Results
Discussion
القيطم استخراج البيض هو نظام البيوكيميائية قوية للتحقيق في دوران β-catenin. تركيز β-catenin في القيطم استخراج البيض هو ~ 25 نانومتر 2. تحت الظروف المثلى، واستخراج البيض قادر على المهينة β-catenin بمعدل 50-100 نانومتر / ساعة ونصف القصوى، في 200 نانومتر 24. وهناك الع?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر لوري لي لقراءة نقدية للمخطوطة. معتمد من قبل TWC دكتوراه مسبقا زمالة جمعية القلب الأمريكية (12PRE6590007). ويدعم MRB من منحة تدريب المعهد الوطني للسرطان (T32 CA119925). ويدعم SSH من قبل المعاهد الوطنية للصحة (R01DK078640). ويدعم EL من قبل المعاهد الوطنية للصحة (R01GM081635 وR01GM103926).
Materials
| Name of Reagent/ Material | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Pregnant Mare Serum Gonadotropin (PMSG) | ProSpec | hor-272-A | Reconstituted with distilled water before use. |
| Human Chorionic Gonadotropin | Sigma | CG10-10VL | |
| Potassium Chloride | Fisher | BP366-1 | |
| Sodium Chloride | Research Products International | S23020-5000.0 | |
| Magnesium Chloride | Fisher | BP214-500 | |
| Calcium Chloride | Acros Organics | AC42352-5000 | |
| HEPES | Fisher | BP310-1 | |
| Cysteine | Acros Organics | AC17360-1000 | |
| Leupeptin | Sigma | L2884-10MG | |
| Aprotinin | Sigma | A1153-10MG | |
| Pepstatin | Sigma | P4265-5MG | |
| Cytochalasin B | Sigma | C8273-10MG | |
| 3 mL syringe: Luer Lock tip | Becton Dickinson | 309657 | |
| 27G1 needle | Becton Dickinson | 305109 | |
| 96 well solid white polystyrene microplate, round bottomed | Corning | 3605 | |
| Steady-Glo Luciferase assay system | Promega | E2520 | Store long-term at -80, can store for up to 1 month at -20 |
| TNT Sp6 coupled reticulocyte lysate system | Promega | L4600 | |
| TNT Sp6 High-yield Wheat Germ protein expression system | Promega | L3260 | Generally higher yield than reticulocyte lysate |
| EasyTag Express Protein Labeling Mix [S35] | Perkin Elmer | NEG772007MC | |
| Creatine phosphate | Sigma | 27920-5G | |
| ATP | Sigma | A2383-5G | |
| Creatine phosphokinase | Sigma | C3755-35KU | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418-50ML | |
| Dual-Glo luciferase assay system | Promega | E2920 | Same storage conditions as Steady-Glo |
| 50 mL Centrifuge tubes | Fisher Scientific | 0556214D | |
| Sorvall SS-34 fixed angle rotor | Thermo Scientific | 28020 | |
| 115 V 50/60 Hz Minicentrifuge | Fisher Scientific | 05-090-128 | |
| mMessage mMachine Sp6 kit | Ambion | AM1340 | |
| Anti-Firefly Luciferase antibody | Abcam | ab16466 | |
| Anti-GSK3 antibody | BD Transduction Laboratories | 610201 | |
| Name of Equipment | Company | ||
| FLUOStar Optima | BMG Labtech | ||
| Sorvall RC-6 Plus Centrifuge | Thermo Scientific | ||
| 16°C Incubator | Percival Scientific |
References
- Glotzer, M., Murray, A. W., Kirschner, M. W. Cyclin is degraded by the ubiquitin pathway. Nature. 349, 132-138 (1991).
- Salic, A., Lee, E., Mayer, L., Kirschner, M. W. Control of beta-catenin stability: reconstitution of the cytoplasmic steps of the wnt pathway in Xenopus egg extracts. Molecular Cell. 5, 523-532 (2000).
- Murray, A. W. Cell cycle extracts. Methods in cell biology. 36, 581-605 (1991).
- Dabauvalle, M. C., Scheer, U. Assembly of nuclear pore complexes in Xenopus egg extract. Biology of the cell / under the auspices of the European Cell Biology Organization. 72, 25-29 (1991).
- Tutter, A. V., Walter, J. C. Chromosomal DNA replication in a soluble cell-free system derived from Xenopus eggs. Methods Mol Biol. 322, 121-137 (2006).
- Theriot, J. A., Rosenblatt, J., Portnoy, D. A., Goldschmidt-Clermont, P. J., Mitchison, T. J. Involvement of profilin in the actin-based motility of L. monocytogenes in cells and in cell-free extracts. Cell. 76, 505-517 (1994).
- Maresca, T. J., Heald, R. Methods for studying spindle assembly and chromosome condensation in Xenopus egg extracts. Methods Mol Biol. 322, 459-474 (2006).
- Shennan, K. I. Xenopus egg extracts: a model system to study proprotein convertases. Methods Mol Biol. 322, 199-212 (2006).
- Kornbluth, S., Yang, J., Powers, M. Analysis of the cell cycle using Xenopus egg extracts. Current protocols in cell biology / editorial board, Juan S. Bonifacino … [et al.]. 11, (2006).
- Chan, R. C., Forbes, D. I. In vitro study of nuclear assembly and nuclear import using Xenopus egg extracts. Methods Mol Biol. 322, 289-300 (2006).
- Masui, Y., Markert, C. L. Cytoplasmic control of nuclear behavior during meiotic maturation of frog oocytes. The Journal of experimental zoology. 177, 129-145 (1971).
- Forbes, D. J., Kirschner, M. W., Newport, J. W. Spontaneous formation of nucleus-like structures around bacteriophage DNA microinjected into Xenopus eggs. Cell. 34, 13-23 (1983).
- Lohka, M. J., Masui, Y. Formation in vitro of sperm pronuclei and mitotic chromosomes induced by amphibian ooplasmic components. Science. 220, 719-721 (1983).
- Newport, J. W., Kirschner, M. W. Regulation of the cell cycle during early Xenopus development. Cell. 37, 731-742 (1984).
- Mitchison, T., Kirschner, M. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 312, 237-242 (1984).
- Blow, J. J., Laskey, R. A. Initiation of DNA replication in nuclei and purified DNA by a cell-free extract of Xenopus eggs. Cell. 47, 577-587 (1986).
- Verma, R., et al. Ubistatins inhibit proteasome-dependent degradation by binding the ubiquitin chain. Science. 306, 117-120 (2004).
- Yu, H., King, R. W., Peters, J. M., Kirschner, M. W. Identification of a novel ubiquitin-conjugating enzyme involved in mitotic cyclin degradation. Curr Biol. 6, 455-466 (1996).
- Thorne, C. A., et al. Small-molecule inhibition of Wnt signaling through activation of casein kinase 1alpha. Nature Chemical Biology. 6, 829-836 (2010).
- Thorne, C. A., et al. A biochemical screen for identification of small-molecule regulators of the Wnt pathway using Xenopus egg extracts. Journal of Biomolecular Screening. 16, 995-1006 (2011).
- Hinkson, I. V., Elias, J. E. The dynamic state of protein turnover: It’s about time. Trends in Cell Biology. 21, 293-303 (2011).
- Kinzler, K. W., Vogelstein, B. Lessons from Hereditary Colorectal Cancer. Cell. 87, 159-170 (1996).
- Lee, E., Salic, A., Kirschner, M. W. Physiological regulation of [beta]-catenin stability by Tcf3 and CK1epsilon. J Cell Biol. 154, 983-993 (2001).
- Lee, E., Salic, A., Krüger, R., Heinrich, R., Kirschner, M. W. The roles of APC and Axin derived from experimental and theoretical analysis of the Wnt pathway. PLoS Biology. 1, (2003).
- Seeling, J. M., et al. Regulation of beta-catenin signaling by the B56 subunit of protein phosphatase 2A. Science. 283, 2089-2091 (1999).
- Guger, K. A., Gumbiner, B. M. beta-Catenin has Wnt-like activity and mimics the Nieuwkoop signaling center in Xenopus dorsal-ventral patterning. Dev Biol. 172, 115-125 (1995).
- Cselenyi, C. S., et al. LRP6 transduces a canonical Wnt signal independently of Axin degradation by inhibiting GSK3’s phosphorylation of β-catenin. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 8032-8037 (2008).
- Jernigan, K. K., et al. Gbetagamma activates GSK3 to promote LRP6-mediated beta-catenin transcriptional activity. Science Signaling. 3, (2010).
- Major, M. B., et al. Wilms tumor suppressor WTX negatively regulates WNT/beta-catenin signaling. Science. 316, 1043-1046 (2007).
- Cross, M. K., Powers, M. Obtaining eggs from Xenopus laevis females. J Vis Exp. , (2008).
- Cross, M. K., Powers, M. Preparation and fractionation of Xenopus laevis egg extracts. J Vis Exp. , (2008).
- Willis, J., DeStephanis, D., Patel, Y., Gowda, V., Yan, S. Study of the DNA damage checkpoint using Xenopus egg extracts. J Vis Exp. , (2012).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. . Early Development of Xenopus Laevis : A Laboratory Manual. , (2000).
- Rubinfeld, B., et al. Binding of GSK3β to the APC-β-Catenin Complex and Regulation of Complex Assembly. Science. 272, 1023-1026 (1996).
- Salic, A., King, R. W. Identifying small molecule inhibitors of the ubiquitin-proteasome pathway in Xenopus egg extracts. Methods in Enzymology. 399, 567-585 (2005).
- Trinkle-Mulcahy, L., et al. Identifying specific protein interaction partners using quantitative mass spectrometry and bead proteomes. J Cell Biol. 183, 223-239 (2008).
- Tan, C. W., et al. Wnt signalling pathway parameters for mammalian cells. PLoS One. 7, (2012).
