Ricostituzione della β-catenina degradazione nel<em> Xenopus</em> Estrai Egg

Summary

Un metodo è descritto per l'analisi degradazione delle proteine ​​usando radioattivo e proteine ​​luciferasi-fusione in estratto uovo Xenopus e il suo adattamento per lo screening high-throughput per piccoli modulatori molecola di degradazione delle proteine.

Abstract

Xenopus laevis estratto uovo è un ben caratterizzato, robusto sistema per studiare la biochimica di diversi processi cellulari. Estratto uovo Xenopus è stato usato per studiare il ricambio proteico in molti contesti cellulari, tra cui il ciclo cellulare e trasduzione del segnale percorsi ^1-3. Qui, è descritto un metodo per isolare estratto uovo Xenopus che è stato ottimizzato per promuovere la degradazione della componente pathway Wnt critico, β-catenina. Due diversi metodi sono descritti per valutare β-catenina degradazione delle proteine ​​in estratti di uova di Xenopus. Un metodo è visivamente informativo ^([35 S] radiomarcato proteine), mentre l'altro è più facilmente scalato per saggi high-throughput (lucciola proteine ​​di fusione luciferasi-tagged). Le tecniche descritte possono essere utilizzate per, ma non sono limitati a, valutare β-catenina turnover proteico e identificare i componenti molecolari che contribuiscono al fatturato. Inoltre, la poslità di purificare grandi volumi di omogenea estratto uovo Xenopus combinata con la lettura quantitativa e facile di proteine ​​luciferasi-tag permette questo sistema di essere facilmente adattato per screening ad alto rendimento per modulatori di degradazione β-catenina.

Introduction

Estratto uovo Xenopus laevis è stato ampiamente utilizzato per studiare molti cellulari processi biologici, tra cui la dinamica del citoscheletro, l'assemblaggio e l'importazione nucleare, l'apoptosi, il metabolismo ubiquitina, progressione del ciclo cellulare, trasduzione del segnale, e proteine ​​fatturato ^1-17. Il sistema estratto uovo Xenopus è riconducibile alla analisi biochimica di una legione di processi cellulari perché estratto uovo rappresenta sostanzialmente citoplasma non diluito che contiene tutti i componenti essenziali citoplasmatici necessari per eseguire questi processi e consentire indagine. Grandi quantità di estratto di uova possono essere preparati in una sola volta per le manipolazioni biochimiche che richiedono grandi quantità di materiale (ad esempio, purificazione di proteine ​​o high-throughput screening) ^18-20. Un altro vantaggio è che la concentrazione di proteine ​​specifiche in estratto uovo Xenopus può essere regolata con precisione mediante aggiunta di proteine ​​e / o immunodeplezione di endog ricombinanteproteine ​​enous in contrasto trasfezione di DNA plasmidico in cui l'espressione della proteina di interesse è difficile da controllare. Inoltre, la mancanza di proteine ​​ricombinanti disponibili può essere superato con l'aggiunta di trascritti codificanti la proteina di interesse, sfruttando elevata capacità estratto uovo Xenopus preparata per tradurre mRNA esogenamente aggiunti.

La regolazione della degradazione delle proteine ​​è fondamentale per il controllo di molte vie cellulari ed elabora ^21. Estratto uovo di Xenopus è stato ampiamente utilizzato per studiare la degradazione delle proteine ​​in quanto il sistema permette diversi modi per monitorare il turnover proteico, senza influenze confondenti di trascrizione e traduzione. La via di segnalazione Wnt è una via di segnalazione altamente conservato che svolge un ruolo critico nello sviluppo e nella malattia. Il fatturato di β-catenina, il principale effettore della via di Wnt, è altamente regolamentato, e un aumento steady-state level di β-catenina è critica per l'attivazione di Wnt geni bersaglio. L'importanza di degradazione β-catenina è evidenziata dal fatto che mutazioni nella via di Wnt che inibiscono la degradazione β-catenina trovare in ~ 90% di tutti i casi sporadici di tumore colorettale ^22. β-catenina degradazione di componenti della via di Wnt può essere fedelmente riassunta in estratto uovo Xenopus per studiare il meccanismo del fatturato nonché per identificare nuovi modulatori piccole molecola della sua degradazione ^{2, 19, 20, 23-29.}

Metodi per la preparazione di estratto uovo Xenopus per studiare il ciclo cellulare sono stati descritti in precedenti pubblicazioni JoVE ^30-32. Il protocollo attuale descrive una modifica di questi metodi ed è ottimizzato per la degradazione di ^[35 S]-radiomarcato β-catenina e luciferasi-tag β-catenina inEstratto uovo di Xenopus. Il test di degradazione radioattivo permette la visualizzazione diretta dei livelli di proteine ​​tramite autoradiografia. ^[35 S] metionina è incorporata nella proteina di interesse utilizzando una reazione di traduzione in vitro che possono poi essere aggiunto direttamente ad una reazione di degradazione. Inoltre, la proteina radiomarcato dosaggio fatturato non richiede un anticorpo contro la proteina di interesse o un epitopo, che può influenzare la stabilità della proteina. Poiché anche piccoli cambiamenti nei livelli di proteine, che si riflette in variazioni dell'intensità della banda di proteina radiomarcato, sono facilmente visualizzati mediante autoradiografia, la ^[35 S]-radiomarcato saggio degradazione rappresenta un metodo molto utile per la visualizzazione di proteine ​​fatturato ^2.

Fusione di β-catenina a luciferasi di lucciola (di seguito denominato semplicemente "luciferasi") consente di misure quantitative precise e facili dei livelli di proteine, al fine diper determinare le proprietà cinetiche di β-catenina fatturato ^{19, 20.} Uno dei principali vantaggi del saggio luciferasi è che fornisce un sistema quantitativo forte che è facilmente calcificato. Il protocollo che segue fornisce metodi semplici per saggiare la degradazione β-catenina e un metodo affidabile, efficiente ed efficace per high-throughput screening nuovi modulatori β-catenina.

Protocol

1. Preparazione di Xenopus estratto Egg NOTA: Ogni rana produce circa 1 ml di estratto uovo utilizzabile. Estratti di 10 rane sono tipicamente preparati in una sola volta, e il volume di tampone di seguito descritto è per l'esecuzione di un 10 rana Xenopus estratto uovo prep. Il volume buffer può essere regolata di conseguenza per preparazioni più o meno grandi di estratto uovo. Preps generato in questa maniera coerente produrre concentrazioni proteiche ≥ 50 mg / ml….

Representative Results

Uno schema di degradazione β-catenina in estratto uovo Xenopus è mostrato in Figura 2A. 35 S-marcato β-catenina è stata incubata in estratto uovo Xenopus, aliquote (1 ml estratto equivalente) sono stati rimossi al momento opportuno, ed i campioni sono stati sottoposti a SDS-PAGE seguita da autoradiografia. β-catenina degradazione di componenti della via di Wnt è mediata dal sistema ubiquitina-proteasoma 2, e il degrado di [35 S]-radiomarcato β-ca…

Discussion

Estratto uovo di Xenopus è un sistema biochimico robusto per indagare fatturato β-catenina. La concentrazione di β-catenina in estratto uovo di Xenopus è ~ 25 Nm ^2. In condizioni ottimali, l'estratto uovo è in grado di degradare β-catenina ad una velocità di 50-100 nM / hr e metà-massimale a 200 nM ^24. Ci sono diversi passaggi critici per il successo ricostituzione del degrado β-catenina con estratto di uova di Xenopus. Questi includono 1) generare Xenopu…

Materials

Name of Reagent/ Material	Company	Catalog Number	Comments/Description
Pregnant Mare Serum Gonadotropin (PMSG)	ProSpec	hor-272-A	Reconstituted with distilled water before use.
Human Chorionic Gonadotropin	Sigma	CG10-10VL
Potassium Chloride	Fisher	BP366-1
Sodium Chloride	Research Products International	S23020-5000.0
Magnesium Chloride	Fisher	BP214-500
Calcium Chloride	Acros Organics	AC42352-5000
HEPES	Fisher	BP310-1
Cysteine	Acros Organics	AC17360-1000
Leupeptin	Sigma	L2884-10MG
Aprotinin	Sigma	A1153-10MG
Pepstatin	Sigma	P4265-5MG
Cytochalasin B	Sigma	C8273-10MG
3 mL syringe: Luer Lock tip	Becton Dickinson	309657
27G1 needle	Becton Dickinson	305109
96 well solid white polystyrene microplate, round bottomed	Corning	3605
Steady-Glo Luciferase assay system	Promega	E2520	Store long-term at -80, can store for up to 1 month at -20
TNT Sp6 coupled reticulocyte lysate system	Promega	L4600
TNT Sp6 High-yield Wheat Germ protein expression system	Promega	L3260	Generally higher yield than reticulocyte lysate
EasyTag Express Protein Labeling Mix [S35]	Perkin Elmer	NEG772007MC
Creatine phosphate	Sigma	27920-5G
ATP	Sigma	A2383-5G
Creatine phosphokinase	Sigma	C3755-35KU
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Sigma	D8418-50ML
Dual-Glo luciferase assay system	Promega	E2920	Same storage conditions as Steady-Glo
50 mL Centrifuge tubes	Fisher Scientific	0556214D
Sorvall SS-34 fixed angle rotor	Thermo Scientific	28020
115 V 50/60 Hz Minicentrifuge	Fisher Scientific	05-090-128
mMessage mMachine Sp6 kit	Ambion	AM1340
Anti-Firefly Luciferase antibody	Abcam	ab16466
Anti-GSK3 antibody	BD Transduction Laboratories	610201
Name of Equipment	Company
FLUOStar Optima	BMG Labtech
Sorvall RC-6 Plus Centrifuge	Thermo Scientific
16°C Incubator	Percival Scientific