שיטה מתוארת לניתוח פירוק חלבונים באמצעות רדיואקטיבי וחלבונים לוציפראז-Fusion בתמצית ביצי Xenopus והתאמת להקרנת תפוקה גבוהה למאפנני מולקולה קטנים של פירוק חלבונים.
תמצית ביצת laevis Xenopus היא מערכת מאופיינת היטב, חזקה ללימוד הביוכימיה של תהליכים תאיים שונים. תמצית ביצי Xenopus נעשתה שימוש כדי ללמוד מחזור חלבון בהקשרים רבים תאיים, כולל את מחזור התא ומסלולים הולכים אותות 1-3. בזאת, שיטה מתוארת לבידוד תמצית ביצי Xenopus שעבר אופטימיזציה כדי לקדם את ההשפלה של המרכיב הקריטי Wnt המסלול, β-catenin. שתי שיטות שונות מתוארות להעריך פירוק חלבוני β-catenin בתמצית ביצי Xenopus. שיטה אחת היא מבחינה ויזואלית אינפורמטיבי ([S 35]-radiolabeled חלבונים), ואילו השני הוא לשנותם בקלות רבה יותר למבחני תפוקה גבוהה (גחלילית חלבוני היתוך מתויג לוציפראז). הטכניקות המתוארות יכולות לשמש, אך אינם מוגבלות, להערכת מחזור חלבון β-catenin ולזהות רכיבים מולקולריים תרמו למחזור שלה. בנוסף, ability לטהר כמויות גדולות של תמצית ביצים הומוגנית Xenopus בשילוב עם קריאת הנתונים הכמותיים וקלילות של חלבונים מתויגים לוציפראז מאפשר מערכת זו כדי להתאים בקלות להקרנת תפוקה גבוהה למאפננים של השפלה β-catenin.
תמצית ביצת laevis Xenopus כבר נעשה שימוש נרחב כדי ללמוד תהליכים בתא ביולוגיים רבים כולל דינמיקת cytoskeletal, הרכבה ויבוא גרעיניים, אפופטוזיס, חילוף חומרים של היוביקוויטין, התקדמות מחזור התא, העברת אותות, ומחזור חלבון 1-17. מערכת תמצית ביצי Xenopus ניתן לניתוח ביוכימי של לגיון של תהליכים תאיים, כי תמצית ביצה מייצגת בעצם ציטופלסמה חי המכילה את כל המרכיבים החיוניים cytoplasmic דרוש לביצוע תהליכים אלו ולאפשר חקירה. ניתן להכין כמויות גדולות של תמצית ביצים בפעם אחת למניפולציות ביוכימיות הדורשות כמויות גדולות של חומר (למשל, טיהור חלבון או הקרנת תפוקה גבוהה) 18-20. יתרון נוסף הוא שהריכוז של חלבונים ספציפיים בתמצית ביצי Xenopus יכול להיות מותאם בדיוק על ידי תוספת של חלבון ו / או immunodepletion של endog רקומביננטיחלבונים בוגדניים בניגוד לtransfection של DNA פלסמיד שבו ביטוי של החלבון של עניין הוא קשה לשליטה. בנוסף, המחסור בחלבונים רקומביננטיים זמינים ניתן להתגבר על ידי התוספת של תמלילים המקודדים את החלבון של עניין, תוך ניצול של הקיבולת הגבוהה של תמצית ביצי Xenopus מוכנה הטרי לתרגם mRNA הוסיף אקסוגני.
הרגולציה של פירוק חלבונים היא קריטית לשליטה רבים מסלולי הסלולר ומעבדת 21. תמצית ביצי Xenopus כבר נעשה שימוש נרחב ללמוד פירוק חלבונים, שכן המערכת מאפשרת מספר דרכים לעקוב אחר מחזור חלבון ללא השפעות מבלבלות של שעתוק ותרגום. מסלול איתות Wnt הוא מסלול איתות שמור ביותר שמשחק תפקידים קריטיים בהתפתחות ומחלה. מחזור של β-catenin, מפעיל העיקרי של מסלול Wnt, מוסדר מאוד, ואני במצב יציב מוגבראיבל של β-catenin הוא קריטי להפעלה של גנים מטרת Wnt. החשיבות של השפלה β-catenin מודגשת על ידי העובדה שמוטציות במסלול Wnt המעכבות השפלה β-catenin מצאו ב~ 90% מכל מקרים ספורדיים של סרטן מעי גס 22. השפלה β-catenin על ידי רכיבים של מסלול Wnt יכולה להיות סכמה בנאמנות בתמצית ביצי Xenopus ללמוד את המנגנון של המחזור שלה, כמו גם לזהות מאפנני מולקולה קטנים רומן של השפלה שלה 2, 19, 20, 23-29.
שיטות להכנה של תמצית ביצי Xenopus לחקר מחזור התא תוארו בפרסומי יופיטר הקודמים 30-32. הפרוטוקול הנוכחי מתאר שינוי של שיטות אלה, והוא מותאם לשפלה של [35 S]-radiolabeled β-catenin ומתויג לוציפראז β-catenin בתמצית ביצי Xenopus. Assay השפלה radiolabeled מאפשר הדמיה ישירה של רמות חלבון באמצעות autoradiography. מתיונין [35 S] הוא שולב החלבון של עניין באמצעות תגובה בתרגום חוץ גופית שלאחר מכן ניתן להוסיף ישירות לתגובת השפלה. בנוסף, assay מחזור חלבון radiolabeled אינו דורש נוגדן נגד החלבון של עניין או תג אפיטופ, שיכול להשפיע על יציבות חלבון. כי אפילו שינויים קטנים ברמות חלבון, כפי שבאו לידי ביטוי בשינויים בעוצמתה של להקת חלבון רדיואקטיבי, הם דמיינו בקלות על ידי autoradiography, [S 35]-radiolabeled assay השפלה מייצג שיטה שימושית מאוד להדמיה של חלבון מחזור 2.
שילוב של β-catenin לגחלילית בלוציפראז (להלן בפשטות "לוציפראז") מאפשר למדידות כמותיות מדויקות וקלילות של רמות חלבון, כדיכדי לקבוע את מאפייני הקינטית של מחזור β-catenin 19, 20. יתרון עיקרי של assay בלוציפראז הוא שהיא מספקת מערכת כמותיים חזקה הלשנותם בקלות. הפרוטוקול הבא מספק שיטות פשוטות למנסה לאמוד השפלה β-catenin ושיטה חזקה, יעילה ואפקטיבית להקרנת תפוקה גבוהה של מאפנני β-catenin רומן.
תמצית ביצי Xenopus היא מערכת ביוכימית חזקה לחקירת מחזור β-catenin. הריכוז של β-catenin בתמצית ביצי Xenopus הוא ~ 25 ננומטר 2. בתנאים אופטימליים, תמצית הביצה היא מסוגלת משפיל β-catenin בשיעור של 50-100 ננומטר / שעה וחצי מקסימאלי ב200 ננומטר 24. ישנם מספר צעדים קריטיים לכינו?…
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים לורי לי לקריאה ביקורתית של כתב היד. TWC נתמך על ידי predoctoral מלגת איגוד לב אמריקאי (12PRE6590007). MRB נתמך על ידי מענק לאומי לסרטן מכון אימון (CA119925 T32). SSH נתמך על ידי המכון הלאומי לבריאות (R01DK078640). EL נתמך על ידי המכון הלאומי לבריאות (R01GM081635 וR01GM103926).
Name of Reagent/ Material | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Pregnant Mare Serum Gonadotropin (PMSG) | ProSpec | hor-272-A | Reconstituted with distilled water before use. |
Human Chorionic Gonadotropin | Sigma | CG10-10VL | |
Potassium Chloride | Fisher | BP366-1 | |
Sodium Chloride | Research Products International | S23020-5000.0 | |
Magnesium Chloride | Fisher | BP214-500 | |
Calcium Chloride | Acros Organics | AC42352-5000 | |
HEPES | Fisher | BP310-1 | |
Cysteine | Acros Organics | AC17360-1000 | |
Leupeptin | Sigma | L2884-10MG | |
Aprotinin | Sigma | A1153-10MG | |
Pepstatin | Sigma | P4265-5MG | |
Cytochalasin B | Sigma | C8273-10MG | |
3 mL syringe: Luer Lock tip | Becton Dickinson | 309657 | |
27G1 needle | Becton Dickinson | 305109 | |
96 well solid white polystyrene microplate, round bottomed | Corning | 3605 | |
Steady-Glo Luciferase assay system | Promega | E2520 | Store long-term at -80, can store for up to 1 month at -20 |
TNT Sp6 coupled reticulocyte lysate system | Promega | L4600 | |
TNT Sp6 High-yield Wheat Germ protein expression system | Promega | L3260 | Generally higher yield than reticulocyte lysate |
EasyTag Express Protein Labeling Mix [S35] | Perkin Elmer | NEG772007MC | |
Creatine phosphate | Sigma | 27920-5G | |
ATP | Sigma | A2383-5G | |
Creatine phosphokinase | Sigma | C3755-35KU | |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418-50ML | |
Dual-Glo luciferase assay system | Promega | E2920 | Same storage conditions as Steady-Glo |
50 mL Centrifuge tubes | Fisher Scientific | 0556214D | |
Sorvall SS-34 fixed angle rotor | Thermo Scientific | 28020 | |
115 V 50/60 Hz Minicentrifuge | Fisher Scientific | 05-090-128 | |
mMessage mMachine Sp6 kit | Ambion | AM1340 | |
Anti-Firefly Luciferase antibody | Abcam | ab16466 | |
Anti-GSK3 antibody | BD Transduction Laboratories | 610201 | |
Name of Equipment | Company | ||
FLUOStar Optima | BMG Labtech | ||
Sorvall RC-6 Plus Centrifuge | Thermo Scientific | ||
16°C Incubator | Percival Scientific |